Создание библиотек и подготовка матрицы

1.

Создание библиотек и подготовка матрицы
Варианты приготовления библиотеки для секвенирования
(химия процесса, наборы Ion Xpress™ Plus, Thermo Scientific®
MuSeek™, Ion TrueMate™, Ion Total RNA-Seq).
Подготовка матрицы (эммульсионная ПЦР, химия процесса).
Устройство и работа систем пробоподготовки OneTouch2 ™ и
Ion Chef ™
«Агентство Химэксперт»

2.

Полная схема процесса
A
B
C
D
E
ДНК
Приготовление
библиотеки
Приготовление
матрицы
Секвенирование
Анализ
данных

3.

Создание библиотек
• Библиотека фрагментов ДНК (Fragment Library)
Ion Xpress™ Plus Library Kit (Ферментативная фрагментация)
Thermo Scientific® MuSeek™ DNA Fragment Library Kit (Фрагментация с лигированием адапторов)
• Библиотека ампликонов (Amplicon Library)
Ion Plus Fragment Library Kit
Ion Xpress™ Plus Library Kit
• AmpliSeq™ библиотеки ДНК и РНК (AmpliSeq™ DNA and RNA Library)
Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0
Ion AmpliSeq™ RNA Library Kit
• РНК (кДНК) библиотеки (RNA-Seq Library)
Ion Total RNA-Seq Kit v2
• Библиотека «16S Metagenomics» (16S Metagenomics Library)
Ion 16S™ Metagenomics Kit
Ion Plus Fragment Library Kit
• Target-Seq библиотеки (Target-Seq Library)
Ion TargetSeq™ Custom Enrichment Kits
• Библиотека «спаренных концов» (Mate Pair Library)
Ion TrueMate™ Library Preparation
3

4.

Создание библиотек
• Библиотека фрагментов ДНК (Fragment Library)
Ion Xpress™ Plus Library Kit (Ферментативная фрагментация)
Thermo Scientific® MuSeek™ DNA Fragment Library Kit (Фрагментация с лигированием адапторов)
• Библиотека ампликонов (Amplicon Library)
Ion Plus Fragment Library Kit
Ion Xpress™ Plus Library Kit
• AmpliSeq™ библиотеки ДНК и РНК (AmpliSeq™ DNA and RNA Library)
Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0
Ion AmpliSeq™ RNA Library Kit
• РНК (кДНК) библиотеки (RNA-Seq Library)
Ion Total RNA-Seq Kit v2
• Библиотека «16S Metagenomics» (16S Metagenomics Library)
Ion 16S™ Metagenomics Kit
Ion Plus Fragment Library Kit
• Target-Seq библиотеки (Target-Seq Library)
Ion TargetSeq™ Custom Enrichment Kits
• Библиотека «спаренных концов» (Mate Pair Library)
Ion TrueMate™ Library Preparation
4

5.

Pub. no. MAN0007210 Rev. 4.0 Date: 30 May 2013 Decision
5

6. Создание библиотеки: Ion Xpress™ Plus Library Kit

• Прост в использовании,
совместим с баркодами,
• 2 часа работы
• Ion Shear® ферментативная
фрагментация ДНК
• Необходимо 50-100 нг
либо 1 мкг ДНК
6

7.

Создание библиотеки: Thermo Scientific® MuSeek™
DNA Fragment Library Kit
75 кДа MuA транспозаза – белок бактериофага
Mu. Формирует гомотетрамерный комплекс с
двумя 50-bp двуцепочечными транспозонными
последовательностями,
содержащими
сайт
связывания с MuA.
• Фрагментирование ДНК при помощи
комплекса транспозаз, присоединение 50
bp инвертированных повторов на оба
конца, затем ПЦР на адапторах для
последующего секвенирования
• Преимущество метода - в сочетании
фрагментации с лигированием адапторов
Время постановки сопоставимо с Ion
Xpress™
• Необходимо небольшое количество ДНК
(50 нг)
7

8.

Создание библиотеки: Mate Pair Library Preparation
for Scaffolding of Genomes
Секвенирование спаренных концов (Mate Pair Sequencing) позволяет секвенировать две
последовательности, располагающиеся в геноме на расстоянии до 10 000 нуклеотидов друг
от друга, как единое целое.
• de novo секвенирование,
• поиск мутаций,
• корректная сборка генома
Image Courtesy http://senayoohoo.wordpress.com/
1–5 мкг гДНК для 3-kb вставок,
10–20 мкг гДНК для 10-kb вставок
8

9.

Создание библиотеки: Ion
TrueMate™ Library Preparation
Workflow
This is a schematic summarizing Ion
TrueMate™ Library construction workflow and
expected sequence context of resulting 400 bp
fragments used for templating and Ion PGM™
sequencing.
10 reactions

10. Ion TrueMate Kit’s True Pair Rates of >95% give better assemblies

Ion TrueMate Kit’s True
Pair Rates of >95% give
better assemblies
Key Performance Metrics:
Construction of “true” mate-pair libraries
• Demonstrated performance of 60%
pairs at >95% true pair rate
Produces LMP libraries with 2-8 kb inserts
at true-pair rates
gDNA input from 2-10ug total
<8 kb protocol does not require the use of
agarose gels (“gel-free”)
Launched Q3 2014

11. Long Mate Pairs Bridge Gaps in Sequencing Data

contig
Frags
Mates
contig
contig

12. Ion AmpliSeq™ для приготовления библиотек

Ультра-мультиплексная ПЦР
Смесь
праймеров
Удаление праймеров
Лигирование адаптеров
Нормализация
библиотеки

13.

Набор Ion Total RNA-Seq Kit V2.0
Единый набор для получения
ориентированной библиотеки
кДНК для любых видов РНК
Библиотека за 6 часов
Может использоваться для анализа как
коротких РНК, так и полного набора
транскриптов в клетке (транскриптома).
Рекомендации:
1–500 нг поли(А) РНК,
10–500 нг тотальной РНК без рРНК
Тотальная РНК высокого качества (RIN >7)
Ion Total RNA-Seq Kit v2 Publication Number 4476286 Revision E © 2013 Life Technologies Corporation

14.

Ligase-Enhanced Genome Detection (LEGenD)
Двуцепочечные гетеродуплексные РНК/ДНК-адаптеры специфично присоединятся к 3’- и 5’-концам РНК
за одну реакцию лигирования
В реакцию вступает одна цепь адаптера, причем только с одним из концов молекулы
Направленное и одновременное присоединение адаптеров РНК-лигазой. LEGenD™ Ligase Mix –
высокоэффективный фермент, специфически распознающий двуцепочечные молекулы.
кДНК синтезируется с отдельного праймера, комплиментарного 3’-адаптеру

15.

Единый набор для получения ориентированной
библиотеки кДНК для любых видов РНК
5’ RNA
adaptor
5’ ligation
junction
3’ ligation
junction
3’ DNA
adaptor
P
P
5’ ‘guide’
adaptor
RNA fragment or
Short RNA 3’-amine
Strand Oriented cDNA
siRNA
12,14,16 nts
3’ ‘guide’ adaptor
(3’ blocked)
3’ RT primer

16.

Приготовление матрицы
A
B
C
D
E
DNA
ДНК
Compatible
Приготовление
Library
Prep
библиотеки
Приготовление
Template Prep
матрицы
Sequencing
Секвенирование
Compatible
Анализ
данных
FASTQ Data
H2O
+
Reagent mix
+
Ion Sphere™ Particles
+
ДНК
+
Реакционное масло

17.

Что проиходит в каждой капле?
P1
Template
P1’
A’
A
+
ePCR Primers
Ion Spheres
B
B
B
B-P1
B
B
B
B
B
B
B
A
Biotin
B

18.

Денатурация
P1
A’
P1’
A
ePCR Primers
Ion Spheres
B
B
B
B-P1
B
B
B
B
B
B
B
A
Biotin
B

19.

Отжиг праймера B-P1 на P1’
B-P1
P1’
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
A
Biotin
B

20.

Достраивание праймера
B-P1
P1’
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
A
Biotin
B

21.

Получен фрагмент (B-P1-Template-A’)
B-P1
P1’
A’
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
A
Biotin
B

22.

Денатурация
A’
B-P1
P1’
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
A
Biotin
B

23.

Биотинилированный праймер A отжигается на
адапторе A’
A
B-P1
A’
Biotin
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B

24.

Достраивание праймера
A
B-P1
A’
Biotin
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B

25.

Получен фрагмент (B’-P1’-Template-A-Biotin)
B’-P1’
A
B-P1
A’
Biotin
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B

26.

Денатурация
B’-P1’
A
Biotin
B-P1
A’
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B

27.

Денатурация
B’-P1’
A
Biotin
Ion Sphere
covered in B
primers
B

28.

Фрагмент (B’-P1’-Template-A-Biotin) отжигается
на праймер B, связанный со сферой Ion Spheres
Ion Sphere
covered in B
primers
B’-P1’
B
A
Biotin

29.

Достраивание праймера
Ion Sphere
covered in B
primers
B’-P1’
B
A
Biotin

30.

Достраивание праймера
Ion Sphere
covered in B
primers
B’-P1’
B
A
Biotin

31.

Фрагмент (B-P1-Template-A’) связан со сферой
Ion Sphere
covered in B
primers
B’-P1’
B
A
A’
Biotin

32.

Ion Spheres покрываются клонально
амплифицированным фрагментом (B-P1-template-A’)
B’-P1’
A
Biotin
Ion Sphere
covered in B
extended
primers
B-P1
A’

33. Устройство OneTouch 2

33

34. Система Ion OneTouch™ 2 System OneTouch™ 2 Instrument и Enrichment System

• Простая в использовании, настольная
система, позволяющая
автоматизировать создание субстрата
(матрицы)
• Минуты ручной работы
• Интегрированы элемент Пельтье для
термоциклирования, насос, а также
сменная одноразовая линия провода
образца
• Поддержка матриц длиной в 200-400
п.н. для секвенировании на Ion PGM™
• Поддержка матриц длиной в 200 п.н.
для секвенировании на Ion Proton™
34

35. Простой автоматизированный рабочий процесс

OneTouch ES
OneTouch Instrument
Простой автоматизированный
рабочий процесс
35

36. Устройство системы OneTouch

36

37.

38. OneTouch в разобранном виде

38

39. OneTouch в разобранном виде

39

40. OneTouch. Ход рабочего процесса.

40

41. OneTouch. Внешний вид расходных материалов.

41

42. OneTouch. Вид центрифуги сверху (с открытой крышкой)

42

43. Приготовление матрицы

A
B
C
D
E
Приготовление матрицы
DNA
ДНК
Compatible
Приготовление
Library
Prep
библиотеки
Приготовление
Template Prep
матрицы
Продукты эмульсионной ПЦР:
1. Моноклональные ISPs
2.
Поликлональные ISPs
3.
Пустые сферы
Sequencing
Секвенирование
Compatible
Анализ
данных
FASTQ Data
43
Confidential and Proprietary -- Do Not Duplicate

44. Подготовка матрицы

• По окончании процесса проводится сбор
всех ионосфер:
1. Моноклональные ISPs
2. Поликлональные ISPs
3. Пустые ISPs
44

45. Проверка качества приготовления матрицы

Кат.ном.:
4468656
- Ion Sphere™ Quality Control Kit
(20 quality control measurements)
45

46. Проверка качества матрицы. Рабочий процесс.

46

47. Механизм процедуры обогащения

47

48. Смысл процедуры обогащения

• По окончании процедуры обогащения
собираются все ионосферы, несущие
матрицу:
• 1. Моноклональные
• 2. Поликлональные
• (пустые сферы удаляются)
48

49. Опции после проведения сбора матрицы

49

50. Устройство OneTouch ES

Сенсорная управляющая
панель
Роботизированная
рука
Место для
наконечника
8-луночный
стрип
50

51. Автоматизированная технология обогащения

Биотинилированная
матрица на ISP
Частицы MyOne
со
стрептавидином
ISP без
матрицы
51

52. Суммирование хода рабочего процесса при использовании OneTouch

Thermal
Cycling
Non-Templated ISP
MyOne Bead +
Streptavidin
Biotinylated
Template + ISP
52

53.

Next-generation sequencing
Ion Chef™
«Агентство Химэксперт»

54. Система Ion Chef™ Полностью автоматизированная пробоподготовка на единой платформе

15 минут ручной работы
• Увеличивает воспроизводимость
• Экономит рабочее время и усилия
Высота
55 см
• Готовит чипы для систем Ion PGM™
и Ion Proton™
• Эмульсификация, амплификация,
отмывка микросфер с ДНК,
обогащение, загрузка чипов.
Ширина
71 см
Глубина
71 cм
54

55. Настольная система Ion Chef Автоматизации приготовления матрицы и загрузки на чип

Загрузчик
чипов
Наконечники
Термоциклер
Обогощение
Холодильник
для реактивов
Модуль для
промывки

56.

Thermal cycler lid
Thermal cycler
Рабочий стол
Used tip rack.
Enrichment
module
New tip rack
Reagent
Cartridge
Cold Station
Tube centrifuges
for ISP recovery
and washing
Solution
Cartridge
Ambient
Station
Chip centrifuge
56

57. Перед запуском системы Ion Chef

• Трэкинг образцов и проверка
перед запуском:
• Система Microscan Vision (камера и
сканер баркодов)
• Возможность трэкинга образцов
• Чипы с баркодами, образцы библиотек
• Проверка запуска
• Скан всех блоков для проверки
правильности настроек
57

58. Очистка после запуска

• Удаление загруженных чипов
• Удаление пластика
• Камера Microscan™ сканирует
поверхность после очистки
• UV-освещение между запусками
для устранения опасности
контаминации
58

59. Сконструирован для поддержки чистоты внутри

• Ламинарный поток для изоляции
«грязных» и «чистых» зон
• Одноразовые расходные материалы
• Запечатанные плашки для
амплификации и закрытые картриджи
и центрифуга (для удержания
аэрозолей)
• UV-радиация для деконтаминации
59

60.

Привычный графический интерфейс
Основанный на интерфейсе систем PGM™, Proton™ и OneTouch2™
60

61. Ion Chef™: приготовление библиотек и нанесение на чип

61

62.

62

63.

63

64.

64

65.

65

66.

66

67.

67

68.

68

69.

69

70.

Bead emulsion nucleic acid
amplification (US 8765380 B2)
Disclosed are methods for nucleic
acid amplification wherein nucleic
acid templates, beads, and
amplification reaction solution are
emulsified and the nucleic acid
templates are amplified to provide
clonal copies of the nucleic acid
templates attached to the beads.
Also disclosed are kits and
apparatuses for performing the
methods of the invention.
http://www.google.com/patents/US8765380
FIG. 1 Schematic of the structure of a DNA capture bead
70

71.

Bead emulsion nucleic acid
amplification (US 8765380 B2)
The following experiment was performed to test the
efficacy of the bead emulsion PCR. For this protocol,
600,000 Sepharose beads, with an average diameter
of 25-35 μm (as supplied my the manufacturer) were
covalently attached to capture primers at a ratio of
30-50 million copies per bead. The beads with
covalently attached capture primers were mixed with
1.2 million copies of single stranded Adenovirus
Library. The library constructs included a sequence
that was complimentary to the capture primer on
the beads.
http://www.google.com/patents/US8765380
FIG. 1 Schematic of the structure of a DNA capture bead
71

72.

Bead emulsion nucleic acid
amplification (US 8765380 B2)
FIGS. 8A-8C Schematic showing
the initial stages of bead
emulsion amplification used in
conjunction with double ended
sequencing. The NHS-activated
bead (FIG. 8A) is attached with
capture primers (FIG. 8B), and
encapsulated in a microreactor
comprising the DNA capture
bead and template (FIG. 8C).
72

73.

Bead emulsion nucleic acid
amplification (US 8765380 B2)
FIG. 9 Schematic showing the
amplification and capture stages
of bead emulsion amplification
used in conjunction with double
ended sequencing. The template
is amplified by solution phase
PCR and the amplification
products are attached to the
DNA capture bead.
73

74.

Bead emulsion nucleic acid
amplification (US 8765380 B2)
FIG. 10 Schematic showing the
later stages of bead emulsion
amplification used in conjunction
with double ended sequencing.
The emulsion is broken down
(FIGS. 10A-10B), the second strand
of the amplification product is
removed and enrichment is used to
maximize the number of beads
bound with amplification product
(FIG. 10C), the sequencing primers
are annealed (FIG. 10D), and the
first strand is sequenced (FIG. 10E),
followed by the second strand.
74

75.

CMOS:
http://www.google.com/patents/US20140264660
http://pdfaiw.uspto.gov/.aiw?docid=20140264660&PageNum=
1&&IDKey=3DB835E9F4FC&HomeUrl=http://appft.uspto.gov/n
etacgi/nphParser?Sect1=PTO1%2526Sect2=HITOFF%2526d=PG01%2526p
=1%2526u=/netahtml/PTO/srchnum.html%2526r=1%2526f=G%
2526l=50%2526s1=20140264660.PGNR.%2526OS=%2526RS=
http://www.google.com/patents/US20140217478
75

76.

Прибор:
https://www.google.com/patents/WO2010138188A1?cl=en&d
q=inassignee:%22Ion+Torrent+Systems+Incorporated%22&hl=e
n&sa=X&ei=CegrVLOMBKa_ygPog4LADw&ved=0CBwQ6AEwAD
gK
http://worldwide.espacenet.com/publicationDetails/originalDo
cument;jsessionid=F5959A1958F32E2A712C1E25EBC3D03D.es
pacenet_levelx_prod_0?CC=WO&NR=2010138188A1&KC=A1&
FT=D&ND=&date=20101202&DB=&&locale=en_EP
76

77.

System and Methods for Making
and Processing Emulsions
(US 20120258516 A1)
https://www.google.com/patent
s/US20120258516?dq=Bead+em
ulsion+nucleic+acid+OneTouch&
hl=en&sa=X&ei=y0rVJeJK8fXyQPOjoCIBA&ved=0C
CYQ6AEwAQ
77

78.

Methods and compositions for
multiplex PCR
https://www.google.com/patents/US20130059762?dq=inassignee:%22Life+Technologies+Corpo
ration%22+AmpliSeq&hl=en&sa=X&ei=OvYrVJD7EoKhyAPT94DoBg&ved=0CEAQ6AEwBQ
78