Иммуноферментный анализ (ИФА) - относится к современным методам ИА и используется для качественного и количественного определения антиген
Области применения ИФА
ИФА типа «сэндвич»
Конкурентный ИФА первом этапе анализа два реагента (for example биологическая проба и коньюгат)
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИФА
ПРОТОКОЛ ИФА
Ферментативная теория свертывания (1902 г. Александр Шмидт (Россия)
Современная схема свертывания крови (5 фаз) – 5-6 мин
Факторы свертывания крови
Классификация факторов свертывания I:
Роль сосудов в остановке кровотечения
Длительность кровотечения по Дуке
СВЕРТЫВАНИЕ КРОВИ IN VITRO - МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОСТАЗА
Протромбиновое время (ПВ), А. Квик, 1935г.
ПВ оценивает внешний механизм свертывания
АЧТВ – оценивает внутренний механизм свертывания
D-димер - продукт деградации фибрина при воздействии на него плазмина. Концентрация D-димера пропорциональна активности фибринолиза (колич
Программа по профилактике и лечению лиц ГПР по ЖДА (из рекомендаций ценрта по Контролю заболеваемости США, 1998)
Группы особого риска по ЖДА
Fe -содержащие белки и их функции в организме
Содержание Fe в различных органах
БАЛАНС Fe в организме определяется:
Выделение (потери) Fe из организма
Лабораторные показатели, характеризующие обмен Fe
Снижение уровня сывороточного Fe
Критерии ВОЗ для диагностики анемии
Железодефицитная анемия (ЖДА)
Причины железодефицитной анемии
Группы особого риска по ЖДА
Стадии формирования ЖДА
I стадия ЖДА. Лабораторные показатели на стадии латентного дефицита Fe 1.Общий анализ крови (ОАК)
II стадия ЖДА. Лабораторные показатели на стадии клинических проявлений ЖДА
Диагностика ЖДА по эритроцитарным индексам
ПОКАЗАТЕЛИ ОБМЕНА ЖЕЛЕЗА (БИОХИМИЧЕСКИЕ)
4.79M
Категории: МедицинаМедицина БиологияБиология

Иммуноферментный анализ

1. Иммуноферментный анализ (ИФА) - относится к современным методам ИА и используется для качественного и количественного определения антиген

Иммуноферментный анализ (ИФА) - относится к
современным
ИА и используется
для антигена
ИФА
- основанметодам
на специфическом
связывании
качественного
и количественного
определения
(АГ)
с соответствующими
антителами(АТ)
с антигенов/
антител в биологических
использованием
ферментаобразцах.
в качестве метки для
регистрации сигнала.
ИФА
Главный принцип ИФА – «узнавание» анализируемого
соединения специфическим к нему антителом.

2.

ELISE (enzyme-linked immunosorbent assay) –
разновидность ИФА - твердофазный ИФА,
Е. Энгвалл и Р. Пэлман (Швеция), 1971 г.

3.

Антиген (Аг) в ИФА - любой патоген (бактерия) или его
фрагмент, а также любое соединение (аналит) к которому можно
подобрать моноклональное антитело (Ат).
Эпитоп (антигенная детерминанта) – участок Аг, который
узнается и связывается Ат.
Антитела:
1. Поликлональные (for example кроличьи антитела против
всех Ig человека);
2. Моноклональные (к определенному классу Ig)
Основные характеристики антител:
Аффинность – степень специфического сродства активного
центра АТ к АГ-детерминанте. При низкой афинности антител
распад комплекса Аг-Ат приводит к удалению связанного Аг из
системы.
Авидность – степень прочности связывания АТ с АГ.
Чем выше аффинность (степень сродства), тем лучше
авидность (прочность связывания)

4.

Области применения ИФА
Диагностика инфекционных и вирусных заболеваний (все инфекции, ВИЧ, гепатиты) выявление АГ и/или специфических АТ к ним;
Кардиомаркеры (hs СРБ, тропонин, миоглобин, NTproBNP);
Определение уровня гормонов (щитовидной железы, надпочечников, половые и т.д.);
Выявление и определение уровня ксенобиотиков (лекарственных препаратов, токсикантов,
наркотических веществ);
Определение уровня иммуноглобулинов (Ig A, М,G, Е, подклассы IgG 1-4);
Определение уровня цитокинов (все IL,интерфероны, ФНО, КСФ и т.д.);
Выявление иммунных комплексов;
Определение уровня опухолевых маркеров (ОМ);
Определение уровня специфических белков крови (ферритин, TRF, фибронектин ,
эритропоэтин и др.);
Определение концентрации ферментов (СОД, глутатионпероксидаза, каталаза и т.д.);
Скрининг моноклональных антител;
Определение компонентов костного метаболизма (маркеров остеосинтеза и резорбции –
(ДПД, С-концевые телопептиды, остеокальцин и т.д.)
Определение факторов свертывания крови (Д-димер)

5. Области применения ИФА

Иммунология;
Инфекционные и вирусные заболевания;
Кардиология;
Патология гемостаза;
Онкология;
Фертильность и репродукция;
Гормоны;
Ветеринария

6.

Варианты ИФА
1. По условиям в которых проводится реакция ИФА:
Гомогенный – нет стадии разделения
иммунохимических комплексов, образовавшихся в
процессе реакции от компонентов не вступивших в
реакцию. Т.е. все реакции протекают в растворе;
Гетерогенный - реакция проводится с реагентами,
фиксированными на поверхности (твердой фазе) с
иммобилизованными на нее АТ (или АГ).

7.

2. По количеству этапов в постановке реакций ИФА:
прямой;
непрямой
3. По количеству реагентов на первом этапе:
конкурентный
неконкурентный

8.

А- непрямой
Б – прямой
В- «сэндвич»

9. ИФА типа «сэндвич»

2
1

10.

Неконкурентный ИФА - на первом этапе
анализа только биологическая проба (1
реагент)

11. Конкурентный ИФА первом этапе анализа два реагента (for example биологическая проба и коньюгат)

12. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИФА

Чувствительность (нижний предел обнаружения) –
минимальная достоверно определяемая концентрация
исследуемого вещества в сыворотке (плазме) крови;
Измеряется в единицах концентрации.
Зависит от концентрации, активности и специфичности
используемых Ат.
Специфичность – характеристика избирательности тестсистемы.
Она показывает насколько вероятно, что реакция будет
протекать с искомым веществом, а не с другими
компонентами исследуемого образца.
Измеряется в %.
Чувствительность и специфичность ИФА повышается
при применении моноклональных Ат.

13. ПРОТОКОЛ ИФА

1.
Внесение биологического образца (сыворотка, плазма и др.) в
лунки планшета на дне которого сорбированы Ат к искомому
аналиту (Аг);
2. Инкубация при определенных условиях
происходит узнавание тестируемого соединения специфическим к
нему Ат/Аг, что ведет к образованию иммунного комплекса;
3. Промывка лунок - удаление несвязавшихся компонентов
реакции;
4. Внесение коньюгата – Ат/Аг меченые ферментом;
5. Инкубация
формируется связь коньюгата с ранее сформировавшимся
иммунным комплексом;
Коньюгат - фермент-Аг (или фермент- Ат)
6. Промывка лунок - удаление несвязавшихся компонентов
реакции;

14.

7. Внесение
субстрат-хромогенной смеси;
8. Инкубация (в темноте);
«ферментная метка превращается в
регистрируемый сигнал
9. Внесение стоп-раствора;
10. Учет результатов с помощью спектрофотометра или
ИФА-ридера.

15.

Учет результатов:
При количественном варианте ИФА параллельно с
анализируемыми образцами исследуют стандартные образцы
(калибровочные пробы),
каждый из которых содержит
исследуемый аналит в
определенной концентрации
По ОП стандартов строится
калибровочная кривая, на
которую затем накладываются
ОП растворов в лунках и определяется концентрация аналита
в биологических образцах и контрольной сыворотке.
О правильности полученных результатов судят по результатам
тестирования контрольных образцов (средняя, SD).

16.

ОСНОВНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ГЕМОСТАЗЕ
Гемостаз - биологическая система, функция которой заключается в
сохранении жидкого состояния крови, остановке кровотечений
при повреждениях стенок сосудов и растворении тромбов,
выполнивших свою функцию в процессе свертывания крови.
Свертывание крови – сложная цепь реакций, в которых участвуют
сосудистая стенка, тромбоциты и факторы свертывания.

17. Ферментативная теория свертывания (1902 г. Александр Шмидт (Россия)

18. Современная схема свертывания крови (5 фаз) – 5-6 мин

1. Образование протромбиназ (тканевой + кровяной) - 3-4 мин;
2. Образование тромбина;
3. Образование фибрина;
4. Полимеризация фибрина и организация сгустка;
5. Фибринолиз - лизис фибринового сгустка, который приводит к
растворению тромба после репарации поврежденной стенки
сосуда.
.

19.

Современная схема свертывания крови
XIIa+Ca2++XIa+III (ФЛ)
тканевая протромбиназа
Кровяная протромбиназа

20.

Протромбиназа (комплекс факторов)
Тромбопластин (III) – Ca2+ (IV) - Xa – Va
III – тромбопластин (тканевой, кровяной, эритроцитарный,
тромбоцитарный;
IV – Ca2+
Xa – активированный ф. Стьюард-Прауэр – основной компонент
протромбиназы;
Va – активированный проакцелерин – ускоритель
ферментативных реакций свертывания

21. Факторы свертывания крови

Факторы свёртывания крови — группа веществ, содержащихся в плазме крови и
тромбоцитах, обеспечивающих свёртывание крови:
Плазменные (17 ф.) - I - XIII;
Тромбоцитарные (14-22 ф.);
Тканевые факторы;
Клеточные (эритроциты, лейкоциты)
Плазменные факторы свертывания преимущественно синтезируются в печени. Ф.
VIII – в клетках эндотелия
Большинство факторов свёртывания — белки (ферменты, кофакторы ферментов,
ингибиторы ферментов). Ca 2+ и др. низкомолекулярные органические вещества.
В норме белковые факторы свёртывания крови находятся в плазме в неактивном
состоянии. В процессе свертывания крови предшественники факторов свертывания
превращаются в их активные формы.

22. Классификация факторов свертывания I:

Субстраты (фибриноген (I);
Ферменты – большинство
Кофакторы ферментов (тканевой фактор, факторы V VIII,
фактор Фицджеральда);
II:
Группа ф/г (I, V, VIII, XIII);
Группа протромбина (II, VII, IX, X);
Контактные факторы (XI, XII, прекалликреин, кининоген)

23.

I ЭТАП СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ
Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз - спазм сосудов и их
механическая закупорка агрегатами тромбоцитов.
Механизм: адгезия, активация и агрегация тромбоцитов на
обнажившихся в результате повреждения коллагеновых волокнах
сосудистой стенки.
В результате образуется
преобладанием тромбоцитов.
«белый тромб» (тромб с

24.

Стадии
Процессы
Адгезия
(прилипание)
тромбоцитов
Тромбоциты прилипают к коллагену и меняют свою форму с
дисковидной на сферическую с множеством выступающих отростков.
Адгезии способствует Фактор Виллебранда и его рецептор на
поверхности тромбоцитов - гликопротеид 1b. В результате из
тромбоцитов высвобождается содержимое альфа-гранул, при этом
реакция является обратимой.
Агрегация
тромбоцитов
В ответ на высвобождение гранул происходит еще более тесная
агрегация тромбоцитов с прилипанием их друг к другу и дальнейшим
изменением формы, в итоге тромбоциты приобретают
отрицательный заряд.
Дегрануляция
тромбоцитов
Тромбоциты высвобождают содержимое дельта-гранул, что вызывает
вторичную необратимую агрегацию.
Тромбоциты вырабатывают тромбоксан А2, который вызывает
сужение поврежденного сосуда.
Стабилизация
тромба
Агрегированные тромбоциты высвобождают фактор V и
тромбоцитарный фактор 3.
Биологическая роль – ускорение каскада реакций свертывания, что в
конечном итоге приводит к укреплению тромбоцитарного и
фибринового тромба.

25.

АКТИВАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ В ПРОЦЕССЕ СВЕРТЫВАНИЯ
КРОВИ
1. Фактор Виллебрандта связывает обнажившийся коллаген сосудов и
тромбоцитарный рецептор гликопротеид Ib;
2. Активация тромбоцитов;
3. А. тромбоциты выделяют факторы (АДФ, тромбоксан), которые активируют
другие тромбоциты;
4. А. тромбоциты выделяют ф. V (акцелератор плазменного каскада)

26. Роль сосудов в остановке кровотечения

Вазоконстрикция (сужение просвета сосуда) осуществляется под
влиянием БАВ тромбоцитов (серотонин, тромбоксан)
приводит к:
- сокращению кровотока через поврежденный участок;
- стимуляции агрегации тромбоцитов;
- контактной активации свертывания с дальнейшим запуском
ферментативных реакций вторичного гемостаза (плазменного)

27.

28.

Лабораторные методы для оценки состояния
первичного гемостаза
Время кровотечения (по Дюке);
Определение количества, размеров и степени зрелости
тромбоцитов (ОАК);
Определение агрегационной функции тромбоцитов;
Определение ф. Виллебранда;
Определение ретракции кровяного сгустка.

29. Длительность кровотечения по Дуке

0борудование и реактивы:
1. Скарификатор;
2. Фильтровальная бумага;
3. Секундомер.
Продолжительность кровотечения (в норме) - 2 - 4 мин.

30.

Кривые агрегации тромбоцитов,
индуцированной АДФ малой концентрации.

31.

Протромбиназа (комплекс факторов)
Тромбопластин (III) – Ca2+ (IV) - Xa – Va
III – тромбопластин (тканевой, кровяной, эритроцитарный,
тромбоцитарный;
IV – Ca2+
Xa – активированный ф. Стьюард-Прауэр – основной компонент
протромбиназы;
Va – активированный проакцелерин – ускоритель
ферментативных реакций свертывания

32.

Современная схема свертывания крови
XIIa+Ca2++XIa+III (ФЛ)
тканевая протромбиназа
Кровяная протромбиназа

33. СВЕРТЫВАНИЕ КРОВИ IN VITRO - МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОСТАЗА

СВЕРТЫВАНИЕ КРОВИ IN VITRO МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОСТАЗА
• Протромбиновое время (ПВ)
• Активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое
время (АЧТВ)
• Тромбиновое время
• Фибриноген
• Продукты деградации фибрина (ПДФ)
• Д-димер

34. Протромбиновое время (ПВ), А. Квик, 1935г.

1) ПВ в норме 12-17 сек;
2) Протромбиновое отношение (ПО)
ПО = ПВ пациента/ПВ контрольной плазмы
(в норме 0,9-1,3);
3) Протромбин (по Квику) – определяется по калибровочному
графику, построенному на нормальной плазме;
4) Международное нормализированное отношение (МНО) = (ПВ
пациента/ПВ контроля x МИЧ*
Референсное значение 0,9-1,3
*МИЧ – международный индекс чувствительности

35. ПВ оценивает внешний механизм свертывания

укорачивается при активации внешнего механизма
свертывания (травмы, хирургические вмешательства,
атеросклероз, инфекции);
удлиняется:
– дефицит или аномалия факторов протромбинового
комплекса (VII, X, V, II);
- прием непрямых антикоагулянтов (варфарин);
- болезни печени;
- дефицит витамина К;
- ДВС в фазе гипокоагуляции

36. АЧТВ – оценивает внутренний механизм свертывания

Норма АЧТВ от 28 до 38 сек
Укорочение АЧТВ:
- при активации внутреннего механизма свертывания (тромбозы)
- ДВС (фаза гиперкоагуляции).
Удлинение:
– дефицит факторов внутреннего пути свертывания (VIII, IX, XI, XII) если
результаты ПВ являются нормальными;
-дефицит II, V, X при гипокоагуляции по результатам ПВ;
-дефицит фактора Виллебранда;
-ДВС (фаза гипокоагуляции)
-заболевания печени
-дефицит витамина К

37. D-димер - продукт деградации фибрина при воздействии на него плазмина. Концентрация D-димера пропорциональна активности фибринолиза (колич

D-димер
- продукт деградации фибрина
при воздействии на него плазмина.
Концентрация D-димера пропорциональна активности
фибринолиза (количеству лизируемого фибрина).
Методы определения:
Одностадийный ИФА.
Специфичность анализа обеспечивается использованием
моноклональных антител, обладающих высокой специфичностью к Dдимеру.
Нормальная концентрация D-димера в крови 0 - 250 нг/мл.

38. Программа по профилактике и лечению лиц ГПР по ЖДА (из рекомендаций ценрта по Контролю заболеваемости США, 1998)

Дети грудного (0-12 мес.) и младшего (1-5 лет) возраста:
Грудное вскармливание или питательные смеси обогащенные Fe;
прикорм в виде фруктов, овощей и соков по достижению 6-месячного
возраста;
Обследование для выявление анемии каждые 6 месяцев.
Дети младшего школьного возраста (5-12 лет) и мальчики-подростки (1218 лет):
Обследование детей с ЖДА или недостаточным потреблением Fe в
анамнезе;
Девочки-подростки (12-18 лет) и женщины детородного возраста вне
периода беременности:
Потребление богатой Fe пищи и продуктов, усиливающих его всасывание;
Обследование каждые 5-10 лет на протяжении всего детородного периода;

39.

Период беременности:
Назначение пероральных препаратов Fe при первом посещении женской
консультации;
Обследование на анемию при первом посещении женской консультации;
При уровне Hg < 90 г/л обеспечить последующее наблюдение;
Послеродовой период:
Факторы риска включают длительную анемию, большую кровопотерю и
многоплодную беременность;
Мужчины старше 18 лет и женщины в постменопаузе:
Плановое обследование не показано.

40. Группы особого риска по ЖДА

o беременных и кормящих грудью - до 70-80%;
o дети в возрасте до 1 года - до 45%.

41. Fe -содержащие белки и их функции в организме

o транспорт O2 и СО2- (гемоглобин, миоглобин);
o окислительно-восстановительные реакции (цитохромы,
пероксидаза, каталаза);
o транспорт и депонирование железа (трансферрин,
ферритин, гемосидерин)

42.

Содержание Fe в белках организма
28-31 мг/кг – в составе Hg;
4-5 мг/кг – в составе миоглобина;
12 мг/кг – ферритина и гемосидерина;
Остальное – в составе гемсодержащих и др. ферментов.

43. Содержание Fe в различных органах

44.

o Трансферрин – транспортный белок (88 кДа), синтезируется в
печени, молекула содержит два центра связывания (2 атома Fe2+).
Биологическая роль – связывает и переносит Fe в эритрокариоциты
костного мозга или в органы-депо Fe (печень и т.д.)
o Ферритин – высокомолекулярный водорастворимый белок (500 кДа),
содержит 20% Fe3+. Содержится практически во всех клетках
организма, в большей степени - в селезенке, печени, костном мозге.
Биологическая роль – депо Fe.
o Гемосидерин - небелковый комплекс нерастворимым в H2O и очень
богатый Fe (37%). Содержится главным образом в макрофагах РЭС
печени и селезенки.
Биологическая роль – изучена недостаточно.

45. БАЛАНС Fe в организме определяется:

1) Поступлением железа в организм с продуктами
питания;
2) Всасыванием железа в органах ЖКТ;
3) Эритропоэзом;
4) Депонированием железа;
5) Потерями железа.

46. Выделение (потери) Fe из организма

• из ЖКТ (кал, желчь, слущивающийся эпителий кишки) 0,6-0,7 мг/сутки;
• через почки - до 0,1 мг/сутки;
• менструации у женщин - от 0,6-1,2 мг до 2,5 мг
железа /сутки. Всего за цикл 2 - 79 мг;
• выделение через кожу (пот) - 0,2-0,3 мг/сутки
Нерегулярные потери - беременность и лактация.

47. Лабораторные показатели, характеризующие обмен Fe

o Сывороточное Fe;
o ОЖСС (общая Fe-связывающая способность сыворотки)
- максимальное количество Fe, которое может
присоединить трансферрин (TRF);
o коэффициент насыщения TRF = сыв. Fe/ ОЖСС;
o Концентрация ферритина;
o Концентрация трансферрина.

48. Снижение уровня сывороточного Fe

При железодефицитной анемии (ЖДА);
при анемиях, связанных с воспалением, острыми
инфекциями;
при заболеваниях органов ЖКТ;
• Опухолях;
• Инфаркте миокарда

49. Критерии ВОЗ для диагностики анемии

Эритроциты <4,0 x109/л,
Hg <130,0 г/л,
гематокрит <39%.
Эритроциты <3,8 x109/л,
Hg <120,0 г/л,
гематокрит <36%.

50. Железодефицитная анемия (ЖДА)

– это анемии, обусловленные нарушением синтеза Hb и
соответственно снижением его количества в единице
объема крови.
Непосредственной причиной является дефицит Fe в
организме.

51. Причины железодефицитной анемии

Кровопотери (различного происхождения)
Врожденный дефицит белка трансферрина;
Анемия у детей
Донорство
Нарушение всасывания железа (хронический энтерит,
резекция 12-перстной кишки и желудка)

52. Группы особого риска по ЖДА

o беременных и кормящих грудью - до 70-80%;
o дети в возрасте до 1 года - до 45%.

53. Стадии формирования ЖДА

I. стадия - скрытый (латентный) дефицит
железа;
II. стадия проявлений ЖДА (синдром
анемии).

54. I стадия ЖДА. Лабораторные показатели на стадии латентного дефицита Fe 1.Общий анализ крови (ОАК)

I стадия ЖДА. Лабораторные показатели на стадии
латентного дефицита Fe
Hb>120 г/л
1.Общий анализ крови (ОАК)
RBC, MCV, MCH, MCHC, RDW – НОРМА
2. Обмен железа:
СЫВОРОТОЧНОЕ ЖЕЛЕЗО - НОРМА ИЛИ СНИЖЕНО,
ТРАНСФЕРРИН - НОРМА
ФЕРРИТИН – СНИЖЕН

55. II стадия ЖДА. Лабораторные показатели на стадии клинических проявлений ЖДА

ОАК:
Hb (гемоглобин) - < 120 г/л
RBC (эритроциты) - норма или снижены;
MCV (средний объем эритроцитов) - менее 80 fl;
MCH - менее 26 пг;
MCHC - менее 320 г/л;
RDW - > нормы. Норма 11,5-14,5%.

56. Диагностика ЖДА по эритроцитарным индексам

RDW
MCV- средний объем эритроцита;
MCH - cреднее содержание Hg в отдельном эритроците (концентрация
гемоглобина / число эритроцитов);
MCHC – средняя концентрация гемоглобина в эритроците
(концентрация гемоглобина/гематокрит);
RDW - колебания объема клеток (коэффициент вариации среднего
объема эритроцитов).

57. ПОКАЗАТЕЛИ ОБМЕНА ЖЕЛЕЗА (БИОХИМИЧЕСКИЕ)

o Уровень сывороточного Fe - снижен;
o Уровень ферритина – резко снижен;
o ОЖСС - повышена;
o Коэффициент насыщения трансферрина - снижен
English     Русский Правила