Разработка композитных скаффолдов на основе коллагена и биоситалла для регенерации костной ткани

1.

Разработка композитных
скаффолдов на основе коллагена
и биоситалла для регенерации
костной ткани
Группа тканевой инженерии
лаборатории клеточных биотехнологий
центра клеточных технологий
института Цитологии Российской академии наук
Финк Максим Александрович
Научные руководители:
• младший научный сотрудник, к.т.н., Дарвиш Д. М.
• научный сотрудник, к.б.н., Александрова С. А.

2.

Актуальность
Тканеинженерные
конструкции
(ТИК)
для
регенеративной медицины бурно развиваются за счет:
Наличие биостимулирующих свойств;
Возможность регулирования времени биодеградации;
Выполнение функции каркаса и питательной среды для
клеточных компонентов;
Наличие адгезивных свойств к клеточным культурам и
стимулировании их пролифирации;
ТИК для замещения костной ткани включают в себя:
Тканеспецифические клетки, способные формировать
функционирующий внеклеточный матрикс;
Биоактивные молекулы, которые оказывают
биостимулирующие действие на клетки поврежденной
ткани;
Биодеградируемый носитель для трансплантации клеток;
*DOI: 10.21926/rpm.2003021
Рисунок 1.
Схема формирования тканеинженерной
конструкции*
2

3.

Структура костной
ткани
Компоненты матрикса костной ткани
Компоненты
костного матрикса
Внеклеточный
матрикс
Интерстициальное
пространство (сеть
канальцев)
Структурные единицы
Органический
компонент
Коллагеновый
Неколлагеновый
Минеральный компонент (в
основном гидроксиапатит (60 – 70 %
веса кости));
Центральные (гаверсовы);
Прободающие (фолькмановские);
Соединяющие (радиальные);
Канальцы;
Межструктурные пространства;
Лакуны;
*DOI: 10.1097/PRS.0b013e31824ec
Рисунок 2.
Структурно-организационное строение костной ткани*
3

4.

Структура костной
ткани
Компоненты матрикса костной ткани
Компоненты костного
матрикса
Структурные единицы
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК);
Клетки
Преостеобласты;
Остеобласты;
Остеоциты;
Остеокласты;
Рисунок 3.
Клетки костной ткани*
*DOI: 10.1097/PRS.0b013e31824e
4

5.

Регенерация костной ткани
Рисунок 4.
Схематическое изображение процесса остеорепарации*
*DOI: 10.1016/j.addr.2014.09.005
5

6.

Биодеградируемые
носители для
трансплантации клеток
Скаффолд – это:
• каркас, носитель или матрица для облегчения миграции,
связывания или переноса клеток или биологически активных
компонентов;
• каркас, трехмерная структура для заселения и культивирования
клеток с целью пространственного формирования будущего
клеточного органа или его фрагмента для трансплантации.
6

7.

Материалы для замещения
костной ткани
Первое поколение (1950-е гг.)
• На основе принципа биоинертности (металлы, пластмассы)
Второе поколение (1980-е гг.)
• На основе принципа биоактивности (резорбируемые материалы, такие как
графты и коллагеновые мембраны)
Третье поколение (XXI в.)
• На основе специфического клеточного ответа на молекулярном уровне
(материалы с функционализированной поверхностью и биомиметической
структурой, такие как композиты с наноструктурами)
7

8.

Материалы для замещения
костной ткани
Биополимеры
• коллаген, фиброин, фибрин, хитозан, альгинат и др.
Синтетические полимеры
• полилактид (PL), полигликолид (PGL), поликапролактон (PCL)
Биокерамика
• гидроксиаппатит (Ca10(PO4)6(OH)2), трикальций фосфат,
биоактивные стекла
Комбинация материалов
8

9.

Материалы на основе
коллагена
Коллагеновые губки
Коллагеновые пасты
Коллагеновые гели
Спрессованный
коллаген
9

10.

Биостекло
Биостекло - биологически активный материал, на основе силикатного стекла, состоящий
из стекловидной матрицы (или органической) и микрокристаллов (волокон),
применяемых для восстановления костной ткани или других тканей в теле человека.
При содержании SiO2 более 65 % - стекло почти инертное.
При содержании SiO2 менее 35 % - стекло не образуется.
При содержании SiO2 › 50 % + Na2O ‹ 35 % + CaO ‹10 % - стекло биоактивно, резорбция в течение 10-30 дней.
Базовые составы биоактивного стекла:
SiO2 (45%) + Na2O (4,5%) + CaO (24,5 %) + P2O5 (6 %).
SiO2 (58%) + CaO (33 %) + P2O5 (9 %).
SiO2 (53%) + Na2O (23%) + CaO (20 %) + P2O5 (4 %).
Диаграмма состояния Na2O-CaO-SiO2
10

11.

Биоситалл
В состав биоситалла входят входят оксиды кальция, кремния, фосфора,
алюминия, магния, цинка, кристаллическая фаза – даллит. Гранулы
белого цвета имеют неправильную форму, механически прочные.
Общая пористость материала достигает 60 – 70 %, что соответствует
пористости губчатой кости человека.
Биоситалл обладает, за счет присутствия карбонатной группы, способностью принимать участие в
кальциево-фосфорном обмене и отвечает всем нижеперечисленным свойствам:
• остеоиндуктивностью, т.е. способностью инициировать митогенез стволовых клеток костного мозга,
хемотаксис клеток – предшественников и их дифференцировку в остеобластном направлении.
• остеокондуктивностью, т.е. - способностью создавать оптимальные пространственные условия роста
новообразующейся костной ткани и обладанием нужной текстурой (размер пор общей пористостью и
структурой);
• остеопротекторностью, т.е. способностью в течении репаративного этапа, создавать условия для
возвращения кости утраченного анатомического объёма и противостоять репарации соединительной
ткани, стремящейся заполнить пространство дефекта кости.
11

12.

Цели и задачи
Цели: Разработать биоматериал для регенерации костной ткани на основе
спрессованного коллагена в композиции с биоситаллом.
Задачи:
1. Провести экстракцию коллагена I типа из сухожилий крысиных хвостов;
2.
3.
4.
5.
Отработать методику формирования коллагеновых гелей с биоситаллом;
Отработать методику формирования спресованного коллагенового геля с биоситаллом;
Отработать методы стабилизации спрессованного коллагена с использованием EDC/NHS*;
Оценить процессы минерализации скаффолда in vitro под действием моделируемой
биологической жидкости (Simulated Body Fluid (SBF));
6. Оценить биосовместимость скаффолда на мезенхимальных стволовых клетках (МСК) костного
мозга.
*1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид / N-Гидроксисукцинимид
12

13.

Экстракция коллагена
• Коллаген был получен методом кислотной экстракции из
сухожилий крысиных хвостов по методике разработанной в
ИНЦ РАН.
• Для указанной методики были составлены технологическая
блок-схема и схемы стадий.
13

14.

Технологическая блоксхема
14

15.

Технологическая блоксхема
Раствор
коллагена I типа
(концентрация 3-5 мг/мл)
15

16.

Формирование гелей
Нейтрализующий
раствор*
pH = 7.4
T = 30 °С
Раствор
коллагена
Коллагеновый гель
Схема эксперимента
*Нейтрализующий раствор на основе солей (NaCl, Na HPO , HEPES)
2
4
16

17.

Формирование гелей с
биоситаллом
Биоситалл
Нейтрализующий
раствор*
pH = 7.4
перемешивание
Раствор
коллагена
Раствор
коллагена с
биоситаллом
T = 30 °С
Коллагеновый гель
с биоситаллом
Схема эксперимента
*Нейтрализующий раствор на основе солей (NaCl, Na HPO , HEPES)
2
4
17

18.

Химизм реакции сшивания
Схема реакции сшивания молекул коллагена состоит
из нескольких этапов:
• Карбоксильные группы остатков аспарагиновой и
глутаминовой кислот коллагена вступают в
реакцию с EDC с образованием интермедиатов
изоацилмочевины.
• Реакционно-нестабильная
изоацилмочевина
реагирует с NHS c образованием полустабильного
эфира.
Схема реакции сшивания коллагена (Col) с помощью имидов*
• Группы карбоновой кислоты, активированные
NHS, затем реагируют с аминогруппами остатков
лизина и гидроксилизина другой молекулы
коллагена с образованием прочной амидной
связи и высвобождают NHS.
Стабилизации спрессованного коллагена производилась с использованием
EDC и NHS в соотношении 5 : 2 : 1
*DOI: 10.31857/S0041377120070044
18

19.

Показатели потери влаги при
прессовании гелей
1
0,9
0,8
0,7
Масса геля, г
200г
0,6
0,5
Несшитые гели
Сшитые гели
0,4
Коллагеновый гель
0,3
Схема эксперимента
0,2
0,1
0
0,797
0,87
Не спрессованные гели
0,256
0,17
Прессование в течении 1
минуты
0,164
0,088
Прессование в течении 3
минут
0,127
0,042
Прессование в течении 6
минут
19

20.

Деградация геля под
воздействием коллагеназы
4
% от всего коллагена в геле
3,5
3
2,5
Несшитые гели
2
Сшитые гели
1,5
1
0,5
0
2,6958
0,5832
Не спрессованный
2,7707
0,6370
Спрессованный (1 мин)
3,1145
0,9559
Спрессованный (3 мин)
3,4873
1,3021
Спрессованный (6 мин)
Анализ белка по методу Лоури в модификации Хартри после деградации геля под воздействием коллагеназы
20

21.

Стабилизация и сжатие
Не сшитый спрессованный
коллагеновый гель с
биоситаллом
Сшитый спрессованный
коллагеновый гель с
биоситаллом
21

22.

Скручивание
спрессованных гелей
Сворачивание не сшитого спрессованного
коллагенового геля с биоситаллом
Сворачивание сшитого спрессованного
коллагена с биоситаллом
22

23.

Минерализация
Для оценки биологической активности использовали выдержку исследуемых
образцов в искусственной среде, имитирующей плазму крови человека (Simulated
Body Fluid - SBF). Образцы помещали в модельную среду при постоянной
температуре 37 ± 0.5°С. Раствор меняли каждые двое суток в течение месяца.
T = 37 °С
Коллагеновый гель с
биоситаллом
Минерализация
в SBF
Минерализованный скаффолд
Схема эксперимента
23

24.

Минерализация
Модификации использованных прописей моделирующего раствора*
*DOI: 10.1002/9783527619443.ch51
24

25.

Минерализация
Не спрессованный
коллагеновый гель с
биоситаллом после
минерализации в i-SBF
Не спрессованный
коллагеновый гель с
биоситаллом после
минерализации в m-SBF
Не спрессованный
коллагеновый гель с
биоситаллом после
минерализации в r-SBF
25

26.

Минерализация
Спрессованный свернутый коллагеновый гель с
биоситаллом после минерализации в m-SBF
26

27.

Оценка биосовместимости
МСК
Минерализованный
скаффолд
ТИК
Схема эксперимента
Цитотоксичность скаффолда;
Адгезия клеток к скаффолду;
Дифференцировка клеток в остеогенном направлении.
27

28.

Выводы и перспективы
o
Проведена экстракция коллагена I типа из сухожилий крысинных хвостов;
Отработана методика формирования коллагеновых гелей с биоситаллом;
Отработана методика формирования спрессованных коллагеновых гелей с биоситаллом;
Отработана методика стабилизации спрессованного коллагена с использованием EDC/NHS;
Оценены процессы минерализации скаффолда in vitro под действием моделируемой
биологической жидкости (Simulated Body Fluid (SBF));
Проводится эксперимент по оценке биосовместимости скаффолда на мезенхимальных
стволовых клетках (МСК) костного мозга.
Запланированные эксперименты:
o Оценка остеоиндуктивных свойств композитного скаффолда по сравнению с другими
подходами к устранению дефектов костной ткани;
Перспективы:
o Рассмотрение технологии в качестве подхода к получению биомедицинского клеточного
продукта.
28

29.

Спасибо за внимание
[email protected]
+79657658610
Финк Максим Александрович
29