Генетическая инженерия
АЛГОРИТМ РАБОТЫ (анализ последовательности)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Форматы файлов, используемых в биоинформатике
АЛГОРИТМ РАБОТЫ (анализ последовательности)
Дополнительный анализ последовательности
Анализ белкового продукта гена
АЛГОРИТМ РАБОТЫ
Вектора – что нужно учитывать
Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора
Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора
Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора
Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора
Область полилинкера –
Область полилинкера
Область полилинкера
Область полилинкера
1 этап
Область полилинкера вектора
АЛГОРИТМ РАБОТЫ
Последовательность целевого гена
Сайты в последовательности целевого гена
Анализ сайтов рестрикции
Сайты в последовательности целевого гена
АЛГОРИТМ РАБОТЫ
Область полилинкера вектора
АЛГОРИТМ РАБОТЫ
Последовательность целевого гена
Подбор праймеров
Подбор праймеров
Подбор праймеров
Подбор праймеров
Прямое клонирование
АЛГОРИТМ РАБОТЫ
Область полилинкера вектора
Введение сайтов рестрикции в праймеры
Расчет температуры отжига праймеров
Прямое клонирование
Прямое клонирование
Прямое клонирование
Прямое клонирование
Введение сайтов рестрикции в праймеры
АЛГОРИТМ РАБОТЫ
Т-вектор

Генетическая инженерия

1. Генетическая инженерия

2. АЛГОРИТМ РАБОТЫ (анализ последовательности)

• Провести BLAST целевой последовательности
• Определить гомологов
• Определить потенциальную функцию белка
• Дать статистическую оценку найденным гомологам

3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

4.

5.

Step 2: Choose the BLAST program

6.

7. Форматы файлов, используемых в биоинформатике

FASTA
>roa1_drome Rea guano receptor type III >> 0.1
MVNSNQNQNGNSNGHDDDFPQDSITEPEHMRKLFIGGLDYRTTDENLKAHEKWGNIVDV
VVMKDPRTKRSRGFGFITYSHSSMIDEAQKSRPHKIDGRVEPKRAVPRQDIDSPNAGATVK
KLFVGALKDDHDEQSIRDYFQHFGNIVDNIVIDKETGKKRGFAFVEFDDYDPVDKVVLQK
QHQLNGKMVDVKKALPKNDQQGGGGGRGGPGGRAGGNRGNMGGGNYGNQNGGGNW
NNGGNNWGNNRGNDNWGNNSFGGGGGGGGGYGGGNNSWGNNNPWDNGNGGGNFGG
GGNNWNGGNDFGGYQQNYGGGPQRGGGNFNNNRMQPYQGGGGFKAGGGNQGNYGN
NQGFNNGGNNRRY
>roa2_drome Rea guano ligand
MVNSNQNQNGNSNGHDDDFPQDSITEPEHMRKLFIGGLDYRTTDENLKAHEKWGNIVDV
VVMKDPTSTSTSTSTSTSTSTSTMIDEAQKSRPHKIDGRVEPKRAVPRQDIDSPNAGATVK
KLFVGALKDDHDEQSIRDYFQHLLLLLLLDLLLLDLLLLDLLLFVEFDDYDPVDKVVLQK
QHQLNGKMVDVKKALPKNDQQGGGGGRGGPGGRAGGNRGNMGGGNYGNQNGGGNW
NNGGNNWGNNRGNDNWGNNSFGGGGGGGGGYGGGNNSWGNNNPWDNGNGGGNFGG
GGNNWNGGNDFGGYQQNYGGGPQRGGGNFNNNRMQPYQGGGGFKAGGGNQGNYGN
NQGFNNGGNNRRY

8.

9.

Step 3: choose the database
nr = non-redundant (most general database)
dbest = database of expressed sequence tags
dbsts = database of sequence tag sites
gss = genomic survey sequences
protein databases
nucleotide databases

10.

Step 4a: Select optional search parameters
organism
Entrez!
algorithm
page 107

11.

Этап 4a: Изменения необязательных параметров
Максимальное кол-во
выравниваний в выдаче
Вероятность нахождения
последовательностей с таким же
скором по случайным причинам
Scoring matrix

12.

Этап 4a: Изменения необязательных параметров
Автоматическая подстройка
под параметров под
короткие
последовательности
Для белка стандартно - 3, можно
установить 2 для короткого белка, или
4-5 для более точного поиска
Автоматическая подстройка под
контекстные особенности
организмов (GC состав)

13. АЛГОРИТМ РАБОТЫ (анализ последовательности)

• Поиск в базах данных всей известной информации:
• http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi

14.

15.

16. Дополнительный анализ последовательности

• http://www.bioinformatics.org/sms2/

17.

18. Анализ белкового продукта гена

19. АЛГОРИТМ РАБОТЫ


НАЙТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ САЙТОВ В
ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА.
ПРОВЕСТИ ПОИСК ЭТИХ САЙТОВ В
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА.
ВЫБРАТЬ САЙТЫ В ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА ДЛЯ
КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА(ВЫБИРАЮТ ТЕ,
КОТОРЫХ НЕТ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО
ГЕНА). Учитывать направление промотора!!!
ПОДОБРАТЬ ПРАЙМЕРЫ К ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ЦЕЛЕВОГО ГЕНА (ПРЯМОЙ И ОБРАТНЫЙ).
ВВЕСТИ В СОСТАВ ПРАЙМЕРОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ВЫБРАННЫХ САЙТОВ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ.
СОСТАВИТЬ СХЕМУ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОЙ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ВЕКТОР.

20. Вектора – что нужно учитывать

21. Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

22. Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

23. Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

24. Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

25. Область полилинкера –

26. Область полилинкера

27. Область полилинкера

28. Область полилинкера

29. 1 этап

1.
НАЙТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ САЙТОВ В
ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА. Bioinformatics.org/SMS/

30. Область полилинкера вектора

Уникальные сайты
(в области полилинкера):
BamHI – GGA TCC
SphI – GCA TGC
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT

31. АЛГОРИТМ РАБОТЫ

• ПРОВЕСТИ ПОИСК ЭТИХ
САЙТОВ В
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ЦЕЛЕВОГО ГЕНА.
Bioinformatics.org/SMS/

32. Последовательность целевого гена

• Atgactgccacgattcccccgttgacaccaacggtaacgcccagcaatcccgatcgcccga
ttgcggatctcaaactacaagacatcattaaaaccctgcccaaggaatgcttcgagaaaaaa
gcgagcaaagcctgggcttctgttttgattaccctaggggcgatcgccgtgggctatttgggcat
tatttatctgccctggtactgcttgcccattacctggatctggacagggacagccttaacggggg
ccttcgttgtcggccatgactgtggccatcgctcctttgctaaaaaacgctgggtcaatgatttag
tgggacatatcgcttttgctcccctcatctaccctttccatagctggcgcctactccacgaccacc
atcacctccacaccaacaaaattgaggttgataacgcctgggatccctggagtgtggaagctt
tccaagccagcccggcgatcgtccggcttttttatcgggccatccggggtcccttctggtggact
ggttccattttccattggagcttaatgcacttcaaactttccaactttgcccaaagggaccgcaat
aaagtcaaattatccattgccgttgtcttcctgtttgcggcgatcgcctttcctgccctaattatcac
cacaggggtgtggggtttcgtcaaattttggctaatgccctggttggtgtatcacttttggatgagc
acttttaccattgtgcaccacaccattcccgaaattcgtttccgtcccgccgccgattggagtgcc
gccgaagcccagttaaatggtactgttcactgcgattatccccgttgggtggaagtgctctgcc
atgacatcaacgtccatattccccaccacctctccgttgccatcccttcctataacctacgacta
gcccacggaagtttaaaagaaaactggggaccttttctttacgagcgcacctttaactggcaat
taatgcaacaaattagtgggcaatgtcatttatatgaccccgaacatggctaccgcaccttcgg
ctccctgaaaaaagtttaa

33. Сайты в последовательности целевого гена

34. Анализ сайтов рестрикции

35.

36. Сайты в последовательности целевого гена

37. АЛГОРИТМ РАБОТЫ

• ВЫБРАТЬ САЙТЫ В
ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА ДЛЯ
КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОГО
ГЕНА(ВЫБИРАЮТ ТЕ, КОТОРЫХ
НЕТ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ЦЕЛЕВОГО ГЕНА).

38. Область полилинкера вектора

Уникальные сайты
(в области полилинкера):
BamHI – GGA TCC
SphI – GCA TGC
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT

39. АЛГОРИТМ РАБОТЫ

• ПОДОБРАТЬ ПРАЙМЕРЫ К
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ЦЕЛЕВОГО ГЕНА (ПРЯМОЙ И
ОБРАТНЫЙ).
Bioinformatics.org/SMS/

40. Последовательность целевого гена

• Atgactgccacgattcccccgttgacaccaacggtaacgcccagcaatcccgatcgcccga
ttgcggatctcaaactacaagacatcattaaaaccctgcccaaggaatgcttcgagaaaaaa
gcgagcaaagcctgggcttctgttttgattaccctaggggcgatcgccgtgggctatttgggcat
tatttatctgccctggtactgcttgcccattacctggatctggacagggacagccttaacggggg
ccttcgttgtcggccatgactgtggccatcgctcctttgctaaaaaacgctgggtcaatgatttag
tgggacatatcgcttttgctcccctcatctaccctttccatagctggcgcctactccacgaccacc
atcacctccacaccaacaaaattgaggttgataacgcctgggatccctggagtgtggaagctt
tccaagccagcccggcgatcgtccggcttttttatcgggccatccggggtcccttctggtggact
ggttccattttccattggagcttaatgcacttcaaactttccaactttgcccaaagggaccgcaat
aaagtcaaattatccattgccgttgtcttcctgtttgcggcgatcgcctttcctgccctaattatcac
cacaggggtgtggggtttcgtcaaattttggctaatgccctggttggtgtatcacttttggatgagc
acttttaccattgtgcaccacaccattcccgaaattcgtttccgtcccgccgccgattggagtgcc
gccgaagcccagttaaatggtactgttcactgcgattatccccgttgggtggaagtgctctgcc
atgacatcaacgtccatattccccaccacctctccgttgccatcccttcctataacctacgacta
gcccacggaagtttaaaagaaaactggggaccttttctttacgagcgcacctttaactggcaat
taatgcaacaaattagtgggcaatgtcatttatatgaccccgaacatggctaccgcaccttcgg
ctccctgaaaaaagtttaa

41. Подбор праймеров

5’- Atgactgccacgattcc…………----………………………………………………
……cgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa – 3’
Прямой праймер – такой же как
последовательность в 5’ области
целевого гена.
Почему?

42. Подбор праймеров

5’- Atg act gcc acg att cc…………----3’ Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Прямой праймер – «садится» на комплементарную цепь (3’ –
5’), следовательно, его последовательность совпадает. В
нашем случае: 5’- atg
act gcc acg att cc – 3’

43. Подбор праймеров

5’- Atgactgccacgattcc…………----………………………………………………
……cgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa – 3’
Обратный праймер – пишется с учетом
правила комплементарности.
Почему?

44. Подбор праймеров

5’- Atg act gcc acg att cc…………----3’ Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Обратный праймер – «садится» на первую цепь (3’ – 5’),
следовательно, его последовательность должна быть ей
комплементарна. В нашем случае – 3’- gag gga ctt ttt tca
aat t – 5’
При заказе на синтез – праймер «переворачивают и пишут
следующим образом: 5’- t taa act ttt ttc agg gag - 3’

45. Прямое клонирование

• Сайты рестрикции можно ввести в 5’область праймера
• Провести ПЦР
• Сделать гидролиз ПЦР-продукта и
вектора соответствующими
эндонуклеазами рестрикции
• Провести лигирование целевого
фрагмента и вектора

46. АЛГОРИТМ РАБОТЫ

• ВВЕСТИ В СОСТАВ ПРАЙМЕРОВ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ВЫБРАННЫХ САЙТОВ ДЛЯ
КЛОНИРОВАНИЯ.
• Были выбраны сайты для SphI –
GCA TGC и SmaI – CCC GGG

47. Область полилинкера вектора

Уникальные сайты
(в области полилинкера):
BamHI – GGA TCC
SphI – GCA TGC
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT

48. Введение сайтов рестрикции в праймеры

5’- Atg act gcc acg att cc…………----3’ Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg
– 3’
act gcc acg att cc
SphI – GCA TGC
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t
gag - 3’
SmaI – CCC GGG
taa act ttt ttc agg

49. Расчет температуры отжига праймеров

(A+T)*2+(C+G)*4 (для праймеров до 20-25 п.н.)
Для праймеров большей длины более сложное:
22+1,46(2*(G+C) +(A+T))
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc
– 3’
(14)*2+(15)*4= 88 градусов
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t
gag - 3’
(16)*2+(14)*4= 88 градусов
taa act ttt ttc agg

50. Прямое клонирование

• Две пары праймеров:
• Одна пара строго на
последовательность целевого гена
Прямой праймер: 5’- atg
att ccg att– 3’
(11)*2+(10)*4= 62 градуса
act gcc acg
Обратный праймер: 5’- t
agg gag ggc - 3’
(13)*2+(9)*4= 62 градуса
taa act ttt ttc

51. Прямое клонирование

• Провести ПЦР с первой парой
• Подобрать вторую пару праймеров с
введенными сайтами рестрикции
(уменьшая число нуклеотидов,
соответствующих целевой
последовательности для оптимизации
температуры отжига)

52. Прямое клонирование

• Провести ПЦР, используя ПЦР-продукт
первой реакции в качестве матрицы
• Сделать гидролиз второго ПЦРпродукта и вектора соответствующими
эндонуклеазами рестрикции
• Провести лигирование целевого
фрагмента и вектора

53. Прямое клонирование

• Через Т-вектор (в случае использования
Taq-полимеразы)
• Тогда сайты рестрикции можно ввести в
5’-концевую часть праймера без
добавления нуклеотидов

54. Введение сайтов рестрикции в праймеры

5’- Atg act gcc acg att cc…………----3’ Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg
– 3’
act gcc acg att cc
SphI – GCA TGC
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t
gag - 3’
SmaI – CCC GGG
taa act ttt ttc agg

55. АЛГОРИТМ РАБОТЫ

• СОСТАВИТЬ СХЕМУ
КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОЙ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В
ВЕКТОР.

56.

Схема клонирования целевого гена в вектор.
Вектор
1. Гидролизуем вектор SphI и SmaI.
2. Проводим разделение
в агарозном геле.
3. ДНК выделяем из геля и
4. Используем для лигирования с
последовательностью целевого гена.
Целевая последовательность
1. Проводим ПЦР с подобранными
праймерами.
2. Клонируем (ПЦР-продукт в Т-вектор).
3. Гидролизуем Т-вектор со вставкой
целевого гена SphI и SmaI.
4. Проводим разделение
в агарозном геле.
5. Фрагмент ДНК соответствующего
размера выделяем из геля и
6. Используем для лигирования в
экспрессионный вектор.

57. Т-вектор

English     Русский Правила