Praktická cvičení z biochemie

1. Snímek 1

Praktická cvičení z
biochemie

2. 1. METODY MĚŘENÍ pH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE

pH a izoelektrický bod
pH = vodíkový exponent/potenciál vodíku - udává zda roztok reaguje kysele či zásaditě
• záporný dekadický logaritmus koncentrace oxoniových (vodíkových) kationtů
Amfion = částice obsahující jak pozitivní, tak negativní elektrický náboj (navenek je elektricky
negativní) – celkový náboj je nulový
• nejčastěji to bývají aminokyseliny (peptidy, bílkoviny)
Izoelektrický bod = hodnota pH při které se látka nachází ve stavu amfionu, takže se
nepohybuje v elektrickém poli (pI = pH izoelektrického bodu)
abychom zabránily vnějším vlivům působící změnu pH používáme pufry
• tlumivé roztoky kyseliny nebo zásady a její soli
• V těle např.: bikarbonátové pufry, hemoglobinové pufry, fosfátové pufry
Proteinátové ionty = bílkoviny plazmy, které při pH=7,4 jsou ve stavu kationtů

3. 1. METODY MĚŘENÍ PH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE

Metody měření pH
Jednoduché metody nejsou velmi přesné.
• indikátorové papírky
• kolorimetrické metody - optické metody založené na porovnávání intenzity
zabarveného roztoku o neznámé koncentraci s roztokem téže látky o známé
koncentraci.
• pH metry velká přesnost (odchylky o 0,01 pH)
Potenciometrie
Elektrochemická analytická metoda, při níž se pomocí pH metru měří rovnovážné napětí mezi
dvěma elektrodami.
První elektroda je indikační (měrná) a jí měřený potenciál je závislý na koncentraci iontů v roztoku,
ve kterém je ponořena.
• Druhá elektroda je referentní (srovnávací) s konstantním potenciálem, nezávislým na koncentraci
iontů v okolním roztoku.
Využití změřeného potenciálového rozdílu - přímo /zjištění pH/
- nepřímo /potenciometrické titrace/

4. 1. METODY MĚŘENÍ pH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE

Potenciometrie
Velikost potenciálu závisí hlavně na koncentraci iontů v roztoku
Hodnotu potenciálu zjistíme pomocí Nernstovy rovnice:
Jako standard (E0) zvolena tzv. standardní vodíková elektroda - potenciál při 25°C = 0,00 V
Přístroje pro měření = pH-metry - cejchované v mV i jednotkách pH ( E=k.pH )
Přístroje pro měření koncentrace iontů = ionometry
Nejdůležitější součást přístrojů - elektrody
Měrné elektrody - potenciál závislý na koncentraci iontů v roztoku (Nernstova rovnice) - elektroda skleněná
Srovnávací elektrody - kalomelová elektroda, argentchloridová elektroda, merkurfosfátová elektroda
Kombinované elektrody - nejčastěji ze skleněné a kalomelové elektrody
Mikroelektrody - měření za anaerobních podmínek v mikrolitrech /měření pH krve/

5. 1. METODY MĚŘENÍ PH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE

Potenciometrická titrace
Při potenciometrické titraci se sleduje závislost potenciálu na objemu
spotřebovaného titračního činidla.
Výsledkem je titrační křivka, která má charakteristický esovitý tvar.
Spotřeba titračního roztoku v ekvivalentním bodě se odečte z grafu nebo se získá
výpočtem.
Ekvivalentní bod = stav, při kterém je látkové množství titračního činidla ekvivalentní
látkovému množství stanovované látky
Výhody: objektivita, nezávislost na volbě indikátoru, možnost titrovat roztoky
zakalené barevně.
Pro přesnost stanovení je důležité spolehlivé a přesné měření objemů.
Vzorce pro výpočet látkové a hmotností koncentrace vzorku:

6. 1. METODY MĚŘENÍ PH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE

Tvary titračních křivek

7. 2. FOTOMETRIE

optická metoda analytické chemie
zabývá se vlastností chemických látek pohlcovat část elektromagnetického záření (nejčastěji světla, IR, UV)
pro látky je specifické pohlcovat různé části spekter s různou intenzitou
dle jejich absorpčních vlastností můžeme zjišťovat koncentrace látek v roztoku či jeho složení
Absorpce záření - lze sledovat pomocí absorpčního spektra (závislosti množství absorbovaného záření na
vlnové délce/vlnočtu)
měření tzv. absorbance dané látky (spektro)fotometrem
ZÁKON LAMBERTŮV-BEERŮV
Prochází-li paprsek monochromatického záření optickou vrstvou, která toto záření pohlcuje, intenzita původního
záření se zeslabí.
• Zákon
platí
pro
monochromatické světlo
a vyjadřuje vztah mezi
absorbancí(A), Tloušťkou
absorbujícího prostření
(l) a jeho koncentrací (c)

8. 2. FOTOMETRIE

Transmitance /propustnost/ - poměr intenzity záření prošlého k intenzitě záření původního
Hodnoty 0 - 1 (0 - 100% )
Absorbance /extinkce/ - logaritmický poměr intenzity původního záření k intenzitě záření prošlého
Hodnoty 0 - ∞
Při absorbanci A= 0 (T = 1) se záření vůbec neabsorbuje / při absorbanci A= ∞ (T= 0) se záření pohltí úplně
absorbanci měří přístroj (fotometr) skrze kyvetu s roztokem jež do přístroje vkládáme
Absorpční křivka – specifická křivka pro chemická činidla jež ukazuje závislost absorpce záření na vlnové
délce
Kalibrační křivka – přímá úměrnost koncentrace látky a její absorbance
• kontrola L-B zákona vynesením závislosti A= f(c)

9. 3. POLARIMETRIE

založená na měření optické otáčivosti - stočení roviny polarizovaného světla opticky aktivní látkou
OPTICKY AKTIVNÍ LÁTKY
Schopnost otáčet rovinu polarizovaného světla
Většinou organické sloučeniny s asymetrickým uhlíkem =chirální uhlík - nese 4 odlišné substituenty
(dále: anorganické látky s asymetrickou molekulou, krystaly)
Podle smyslu otáčení:
PRAVOTOČIVÉ (+) a LEVOTOČIVÉ (-)
Úhel otočení souvisí se strukturou látky a koncentrací
Charakterizující konstanta opticky aktivních látek - Měrná otáčivost
o Závisí na vlnové délce, teplotě a koncentraci
Měření optické otáčivosti polarimetrem

10. 3. POLARIMETRIE

Měřením získáme úhel otočení (ve stupních) potřebný pro vypočítání koncentrace látky
VYUŽITÍ POLARIMETRIE:
Kontrola čistoty směsí chirálních látek,
Měření koncentrace sacharidů v cukrovarnictví a potravinářském průmyslu
ve farmacii a biochemii stanovení bílkovin, steroidů, vitamínů či alkaloidů

11. 5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA

DIFUZE
je pohyb částic ve směru koncentračního gradientu, tak aby došlo k vyrovnání koncentrace ve všech místech
soustavy
důsledkem neuspořádaného pohybu částic (nezávisle na gravitaci)
OSMÓZA:
Dva různě koncentrované roztoky od sebe odděleny semipermeabilní membránou propustnou pouze pro molekuly
rozpouštědla
část rozpouštědla přejde z místa nižší koncentrace do místa s vyšší koncentrací tak, aby došlo k vyrovnání rozdílu
OSMOTICKÝ TLAK:
tlak, který musíme vyvinout na koncentrovanější roztok, aby se zabránilo osmóze.
ONKOTICKÝ TLAK:
osmotický tlak bílkovinné složky plazmy a činí cca 0,3% celkového osmotického tlaku plazmy.
REVERZNÍ OSMÓZA
na roztok působí tlak, která je od čistého rozpouštědla oddělen polopropustnou membránou
Při dostatečném tlaku dochází k opačnému toku rozpouštědla než u osmosy

12. Příklady osmózy

5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA
Příklady osmózy

13. 5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA

OSMOLALITA
Pro vyjádření osmotických poměrů v roztoku
Vyjadřuje celkové látkové množství všech osmoticky aktivních částic rozpuštěných v jednotkové hmotnosti
čistého rozpouštědla
Jednotkou je mol/kg resp. mmol/kg
Osmolalitě 1mol/kg odpovídá osmotický tlak 2,7 Mpa
Osmolalita moči: 50-1400 mmol/kg H2O – v rozmezí se pohybuje v závislosti na pitném režimu a koncentraci
iontů v organismu
TONICITA
Rozdíl osmotického tlaku mezi prostředími
V lidské fyziologii ve krevní plasmě
IZOTONICKÝ ROZTOK - stejný osmotický tlak jako plasma
HYPOTONICKÝ ROZTOK - nižší osmotický tlak než plasma
HYPERTONICKÝ ROZTOK - vyšší osmotický tlak než plasma

14. 5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA

DIALÝZA
Dělící metoda, při niž se uplatňuje difúze a současně polopropustnost membrány
děj, při kterém jsou od sebe odděleny látky s různou rozpustností a velikostí molekul
Prakticky se tak děje přechodem analyticky disperzních látek přes polopropustnou membránu z
prostředí s vyšší koncentrací těchto látek do prostředí s nižší koncentrací
HEMODIALÝZA
metoda odstraňování odpadních látek jako např. draslík, močovina, a nadbytečné vody z krve při
selhání ledvin
Krev pacienta proudí kolem semipermeabilních membrán, které dovolují vyrovnání koncentrací
nízkomolekulárních látek s dialyzačním roztokem na druhé straně membrány, zatímco plasmatické
proteiny a krevní buňky přes dialyzační membránu neprocházejí a neztrácení se
PERITONEÁLNÍ DIALÝZA - na rozdíl od hemodialýzy využívá peritoneum pacienta
DIALYZAČNÍ ROZTOK - vodný roztok obsahující glukózu a různé ionty (např. draselné, sodné…)

15. 5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA

KRYOSKOPIE
Metoda založena na kryoskopickém efektu - snížení teploty tuhnutí rozpouštědla po rozpuštění dané
látky
Měření kryoskopem (osmometrem)
KRYOSKOPICKÝ EFEKT - snížení teploty tuhnutí
EBULIOSKOPICKÝ EFEKT - zvýšení bodu varu
Vlastnost závisí na počtu částic, ne na jejich identitě
Rozdíl teplot tuhnutí a čistého rozpouštědla je přímo úměrný osmolalitě a nepřímo úměrný molární
hmotnosti rozpuštěné látky

16. ???otázka??? ANTIOXIDANTY

Při metabolických pochodech vznikají reaktivní formy kyslíku ROS a reaktivní formy dusíku RNS
Souhrnně označované jako RONS
Zahrnují volné radikály i látky neradikálové povahy

17. ???otázka??? ANTIOXIDANTY

látky schopné reagovat a ukončit existenci volných radikálů
Vyčerpání antioxidantů v těle vede k poškození tkáně v důsledku procesů označovaných jako oxidační
stres (sportování, psychický stres…)
Antioxidační kapacita - míra schopnosti tkáně odolávat oxidačnímu stresu, závislá na množství a druhu
antioxidantů ve tkáni
VOLNÉ RADIKÁLY
= molekuly, atomy či ionty, schopné samostatné existence mající alespoň jeden volný nepárový elektron ve valenční
sféře
Vznikají:
1) Homolitické štěpení kovalentní vazby na dvě částice
2) Redukce -přidáním jednoho elektronu
3) Oxidací -ztrátou jednoho elektronu
Šíří se jako řetězová reakce. Volný radikál se stabilizuje vytržením elektronu z nejbližší molekuly, která se pak stává
radikálem.

18. ???otázka??? ANTIOXIDANTY

PŘÍČINY VZNIKU RADIKÁLŮ
Do organizmu se volné radikály dostávají z vnějšího prostředí, ale celá řada z nich vzniká i během
metabolických procesů
Rozdělujeme příčiny jejich vzniku na exogenní a endogenní:
Exogenní: ionizující záření, UV záření, vysoký obsah škodlivin ve vzduchu, kouření, intoxikace, potrava
Endogenní: vznik kyseliny močové, rozpad fagocytů a makrofágů, vznik methemoglobinu, syntéza
prostaglandinů, zvýšený metabolizmus estrogenů, autooxidace thiolů, hyperglykémie
DISMUTACE A FENTONOVA REAKCE
Protože se superoxidový radikál řadí mezi nestabilní molekuly, v organizmu snadno podléhá dismutaci za
vzniku zmíněného peroxidu vodíku:
O2-· + O2-· O2+ H2O2
Ten je relativně stabilní a má schopnost pronikat v tělních tekutinách i do větších vzdáleností. S
biologickými molekulami reaguje velmi pomalu a jeho reakcí s dvoumocným železem vzniká hydroxylový
radikál (Fentonova reakce):
H2O2 + Fe2+ Fe3+ + ·OH + OH- .
Trojmocné železo může být redukováno superoxidem, takže se kruh pro další uzavírá.

19. ???otázka??? ANTIOXIDANTY

NERADIKÁLY
neradikály mohou snadno v radikály přecházet a tím mohou poškozovat buňku
mohou vznikat reakcí dvou radikálů (-> nepřímo nám řeknou, že v těle radikály jsou)
NO• + O2•- ——→ OONOPeroxynitrit OONO- je silné oxidační činidlo
Fentonova reakce:
H2O2 + Fe2+ → HO• + OH− + Fe3+
místo železa může být i jiný přechodný kov (Cu,Zn,..)
hydroxylový radikál HO• je silné oxidační činidlo
vytrhuje elektron z nenasycených mastných kyselin
hydroxyluje AMK a baze NK

20. 8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE

CHROMATOGRAFIE
Dělící metoda, při niž se distribuují složky mezi stacionární a mobilní fází
Mobilní fáze - kapalina nebo plyn
Stacionární fáze - pevná látka nebo kapalina
Složka s velkou KD je převážně ve stacionární fázi a bude se pohybovat pomaleji než složka v malou KD,
která je převážně ve fázi mobilní
Čím více se látka váže na stacionární fázi, tím pomaleji se pohybuje
Čím více se látka váže na fázi mobilní, tím rychleji se pohybuje

21. 8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE

ROZDĚLENÍ CHROMATOGRAFICKÝCH METOD PODLE ZPŮSOBU PROVEDENÍ
SLOUPCOVÁ CHROMATOGRAFIE (chromatografie na koloně)
Kolona - trubice naplněná chromatograficky aktivním materiálem
Udává se poměr vnitřního průměru kolony a délky sloupce pevné fáze
Impregnace - zakotvení stacionární fáze na nosič nanesení vzorku vyvýjení
Eluát - mobilní fáze vytékající z kolony
v průběhu eluce se postupně sbírají frakce buď ve stejných časových intervalech nebo se odebírá stejný objem
Vyhodnocení nejčastěji fotometricky, grafickým znázerněním průběhu eluce - eluční křivka
CHROMATOGRAFIE V PLOŠNÉM USPOŘÁDÁNÍ
Stacionární fáze - arch chromatografického papíru nebo tenká vrstva adsorbentu na pevné podložce
Obvykle pouze identifikace látek, práce se standardy
Identifikace látek pomocí retardačního faktoru Rf
Místo nanesení vzorku - start
Poloha mobilní fáze v okamžiku přerušení vyvíjení - čelo
Retardační faktor = poměr vzdálenosti start - těžiště skvrny vzorku (A) ku vzdálenosti start - čelo (B)

22. 8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE

ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE
Stacionární fáze je kapalina (na vhodném nosiči), která se nemísí s kapalinou mobilní fáze
K dělení dochází, mají-li látky rozdílné rozdělovací konstanty
Chromatografický papír
stacionární fáze – voda vázaná asi 5% na celulosu
mobilní fáze – organické rozpouštědlo nebo jejich směsi s vodou
dělení:
vzestupná – rozpouštědlo zdola nahoru
sestupná – naopak
kruhová – radiálně od středu papíru
dvojrozměrná – nejprve v jednom směru a poté ve směru kolmém na směr první
Vyvíjení ve skleněných uzavřených komorách usušení chromatogramu postříkat vhodným
činidlem(výrazná barevná reakce), někdy UV detekce
Vyhodnocení pomocí retardačního faktoru a srovnání s paralelně nanesenými standardy
Rf=A/B
A=start-těžiště skvrny,
B=start-čelo

23. 8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE

ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE
Stacionární fáze - pevná látka s adsorpčními vlastnostmi
mobilní fáze - kapalina nebo plyn
Směsi se dělí na základě rozdílné adsorpční afinity stacionární fáze k molekulám rozpuštěných látek.
TLC – TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE
Mobilní fáze - organické rozpouštědlo
Tenká vrstva stacionární fáze - oxid křemičitý spojený sádrou nebo škrobem (v případě dělení rostlinných
pigmentů), vhodný hydrofilní absorbent je oxid hlinitý poutá nejpevněji vodu.
Vlastní vzorek není ponořen do rozpouštědla, ale rozpouštědlo se na start dostává jen vzlínáním

24. 9. IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE A GELOVÁ FILTRACE

IONTOVĚ VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE (IONEXOVÁ)
Stacionární fáze - iontoměnič, ionex
mobilní fáze - kapalina
Metoda slouží k dělení látek iontové povahy - působením elektrostatických sil mezi ionty rozpuštěnými v
mobilní fázi a disociovanými funkčními skupinami iontoměniče
Iontomeniče - anorganické nebo organické vysokomolekulární látky - schopny vyměňovat ionty
Důležitá konstanta - kapacita (C) - udává látkové množství iontu, které je schopen zachytit 1 ml ionexu
Katex - nerozpustná, vhodně zesíťovaná makromolekulární látka - na svém řetězci anorganická, snadno
disociovatelná funkční skupina (např -SO3H)
Ve styku s vodou molekuly vody vyponí oka katexu protony se shromažďují uvnitř ok voda vně ok -
mizivé množství protonů, zatím co uvnitř ok je koncentrace protonů vysoká přidání roztoku disociované soli
kationty Na+ do nitra katexu a vytěsní ekvivalentní množství iontů H+ , které místo nich uniknou do okolí
Anex - podobné vlastnosti jako katex, ale vyměňují anionty

25. Snímek 25

9. IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE A GELOVÁ FILTRACE
GELOVÁ CHROMATOGRAFIE
Stacionární fáze- polymerní gel pravidelného prostorového uspořádání
mobilní fáze - kapalina
Složky se dělí na základě rozdílné velikosti molekul
látky, jejichž molekuly jsou větší než průměr pórů v gelu, nemohou do něj proniknout a postupují
vpřed s mobilní fází. Menší molekuly pronikají do prostorových děr a jejich pohyb se zpomaluje
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
umožňuje oddělit z komplexní směsi přinejmenším omezenou skupinu příbuzných proteinů, nebo i jen
jeden určitý protein
technika je založena na použití imobilizovaného ligandu (navázán na stacionární fázi) reagující
specificky s enzymem, který má být očištěn
Po přidání směsi proteinů k takovémuto ligandu se na něj vážou jen ty proteiny, které s ligandem tvoří
silné vazby
Zbytek směsi protéká kolonou beze změny odváděn mobilní fází.
Navázaný protein se následně euluje z imobilizovaného ligandu pomocí vysoce koncentrovaného
roztoku solí nebo i roztokem s rozpustnou formou ligandu.

26. Snímek 26

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)
Metoda rychlého a snadného zmnožení určitého úseku nukleové kyseliny
Výsledkem je zmnožení izolované NK (teoreticky stačí i 1 molekula NK a mohu z ní vytvořit miliardy)
Množství kopií roste exponenciálně
SLOŽKY REAKČNÍ SMĚSI
• Templát - izolovaná DNA – čím víc a čistší, tím lepší (proto předtím měřím množství a čistotu na
spektrofotometru)
• Primery – specifické komplementární úseky DNA (v buňkách RNA); jsou dva – každý v jednom směru
polymerace DNA; umožňují nasednutí DNA polymerázy; u PCR také ohraničují úsek DNA, který chci
namnožit; nesmí obsahovat vnitřně komplementární sekvence – nežádoucí tvorba „smyček“
• DNA polymeráza – používá se Taq polymeráza – může fungovat při vysokých teplotách, při kterých je
DNA ještě denaturována
• Základní reakční roztok – obsahuje deoxynukleotidtrifosfáty, pufr, soli (vhodné iontové prostředí) a
hořečnaté ionty (kofaktor polymerázy)

27. Snímek 27

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)
PRINCIP
• 1. denaturace – zahřátí na 95°C; dsDNA se rozdělí na ssDNA
• 2. hybridizace – dosednutí primerů (50-60°C)
• 3. elongace – syntéza nových řetězců (65-75°C), nukleotidy přiřazovány od primerů ve směru
5'→3'
• Princip se opakuje mnohokrát (např. 30x), na konci máme spoustu kopií úseku DNA z obou
stran vytyčeného specifickými primery

28. Snímek 28

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)
VYUŽITÍ
Využívá se např. pro sekvenování DNA, analýzu genů, kvantifikace množství cílové sekvence ve vzorku
(qPCR), analýza genové exprese (RT-PCR)
diagnostika infekčních onemocnění, identifikace dědičných chorob, identifikace osob – genetická
daktyloskopie

29. Snímek 29

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)
ELEKTROFORÉZA
patří mezi separační metody izolující molekuly o rozdílné hmotnosti, popř. odlišném elektrickém
náboji, využívající jejich odlišnou pohyblivost v elektrickém poli
Využití – diagnostika monogenních chorob, analýza a dělení směsí bílkovin
• ELEKTROFORÉZA NUKLEOVÝCH KYSELIN
DNA namnožím pomocí PCR a nastříhám restrikčními endonukleázami (enzymy štěpící DNA ve
specifickém místě – pokud je DNA mutovaná enzym není schopen DNA štěpit – vzniknou delší
fragmenty – detekce mutace)
Nanesu do „vaniček“ v gelu (ty jsou poblíž katody)
Fragmenty DNA se „prodírají“ gelem směrem k anodě, menší fragmenty mají vyšší rychlost, větší
naopak nižší – kratší docestují v čase dál než delší
V daném čase elektroforézu zastavím a odečtu výsledek (bandy v určité vzdálenosti) – na základě
přítomnosti fragmentů o určité délce mohu potvrdit, nebo vyvrátit přítomnost jedné, nebo obou
mutovaných alel dědičné choroby

30. Snímek 30

35. POLYMERASOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)
ELEKTROFORÉZA
• ELEKTROFORÉZA BÍLKOVIN V SÉRU
Bílkoviny – amfolyty – náboj v závislosti na pH – elektroforéza probíhá v pufru o určitém pH
Většina bílkovin – slabě kyselé (pH 5-6) – elektroforéza probíhá v alkalickém pufru (pH 8,6) –
pohyb k anodě – různá rychlost
Poloha a koncentrace bílkovin v jednotlivých frakcích se následně hodnotí pomocí denzitometrie

31. Snímek 31

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA
HEMOKOAGULACE = SRÁŽENÍ KRVE
• soubor enzymatických reakcí
• výsledkem přeměna tekuté krve v nerozpustný gel
• je to proces hemostázy = zástavy krvácení
• Fáze hemokoagulace:
• Tvorba aktivátoru protrombinu z faktoru X a V
• Přeměna protrombinu na trombin
• Přeměna fibrinogenu na fibrin
=>tvorba aktivátoru protrombinu limitujícím faktorem celého děje

32. Snímek 32

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA
HEMOKOAGULAČNÍ KASKÁDA
Aktivátor protrombinu vzniká vnější nebo vnitřní hemokoagulační kaskádou
• Vnější: poškození cévní stěny uvolnění tkáňového tromboplastinu (=faktor III) aktivace
faktoru VII Ca2+ a faktor VII aktivace faktoru X faktor X a faktor V vytváří aktivátor
protrombinu
• Vnitřní: krev + negativně nabitý nebo smáčivý povrch aktivace faktoru XII faktor XII reaguje
s prekalikreinem a kininogenem přeměna faktoru XI na aktivní formu aktivovaný faktor XI a
Ca2+ ionty aktivace faktoru IX aktivovaný faktor IX a VIII, destičky a Ca2+ aktivace faktoru X
aktivovaný faktor X a faktor V vytváří aktivátor protrombinu

33. Snímek 33

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA
LEIDENSKÁ MUTACE
autosomálně dominantně dědičná bodová mutace v genu pro hemokoagulační faktor V
Krevní srážlivost je zvýšená
Projevuje se trombofilními komplikacemi, nejčastěji trombózami žil s rizikem následné plicní
embolie
Záměna nukleotidu guaninu za adenin substituce argininu za glutamin odolnost faktoru V
vůči proteinu C, který ho má degradovat nedochází k inhibici hemokoagulační kaskády
K léčení trombofilních stavů se používají kumarinové deriváty (warfarin = antivitamin K) a heparin

34. Snímek 34

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA
LABORATORNÍ TESTOVÁNÍ HEMOKOAGULACE
• Testování vnějšího systému:
protrombinovým časem = doba, za kterou se v plazmě vytvoří fibrinové vlákno po přidání
vápenatých iontů a tromboplastinu (neměl by být delší než 11-13 sekund)
INR- normalizovaný poměr naměřené hodnoty času u pacienta a času u normální plazmy,
ideálně jedna
Používá se k sledování kumarinové terapie
• Testování vnitřního systému:
aktivovaným parciálním tromboplastinovým časem (aPTT) = doba (fyziologicky 25,9-40s), za
kterou se ve sledované plazmě vytvoří fibrinové vlákno po spuštění koagulační kaskády směsí
látek aktivujících faktor XII (kaolin-kefalinový komplex nahrazuje negativitu kolagenu, který ji
spouští in vivo)
Používá se k sledování heparinové terapie
Poměr k normální plazmě 0,83-1,3
Prodloužení doby – hrozí krvácení; zkrácení doby - nebezpečí vzniku trombů

35. Snímek 35

36.+37. FAKTOR V LEIDEN - MEDICÍNSKÝ VÝZNAM A DIAGNOSTIKA
PRODLOUŽENÍ DOBY HEMOKOAGULACE - PŘÍČINY
• hemofilie A (nedostatek f. VIII), hemofilie B (nedostatek f. IX), hemofilie C (nedostatek f.
XI);
léčba heparinem
léčba Warfarinem
von Willebrandova choroba – hereditární porucha tvorby vW faktoru, který je nosičem
faktoru VIII a ovlivňuje tak jeho aktivitu;
antifosfolipidový syndrom – přítomnost protilátek proti fosfolipidům;
konsumpční koagulopatie – DIC.