Физиология прокариот. Лекция 2

1. Физиология прокариот

Лекция 2

2. Классификация бактерий по источнику углерода

• Автотрофы (лат. autos – сам, trophe – питание) -синтезируют все
углеродсодержащие компоненты клетки из СО2,
• Гетеротрофы (лат. heteros – другой) - используют готовые органические
углеродсодержащие соединения:
гексозы (глюкоза),
многоатомные спирты,
углеводороды, органические кислоты,
аминокислоты и др.:
• из окружающей среды – сапрофиты,
• живой клетки – паразиты:
• облигатные = только живой клетки:
• риккетсии
• хламидии
• факультативные = наряду с органическими соединениями окружающей
среды – (большинство патогенных бактерий)

3. Классификация бактерий по источнику энергии

• Фототрофы (фотосинтезирующие) -используют солнечную энергию,
например: зеленые или пурпурные бактерии
• Хемотрофы (хемосинтезирующие) - получают энергию за счет
окислительно-восстановительных реакций,
например: серобактерии,
железобактерии,
нитрифицирующие бактерии и др.

4. Классификация бактерий по природе донора электронов

• Литотрофы (греч. litos – камень) - хемотрофные организмы,
которые используют неорганические соединения: Н2,
H2S,
СН3 и др.
• Органотрофы - хемотрофные организмы, которые
органические соединения: сахара,
оксикислоты,
многоатомные спирты
используют

5. Классификация бактерий по источнику азота

• Прототрофы - усваивают азот из: атмосферы,
солей аммония,
нитратов,
нитритов,
глюкозы;
- способны сами синтезировать все компоненты клетки.
• Ауксотрофы - усваивают готовые азотсодержащие вещества из
окружающей среды или организма хозяина;
-теряют способность к синтезу какого-либо вещества и требуют его наличия в
среде культивирования.
• Вещество наз-ся фактор роста.

6. Факторы роста бактерий

Аминокислоты:
Лейцин, тирозин необходимы для клостридий;
лейцин, аргинин – для стрептококка
Пуриновые и пиримидиновые Аденин, гуанин, цитозин, урацил, тимин - для
основания:
стрептококков
Липиды:
Витамины:
Железопорфирины:
Жирные кислоты – для стрептококков,
холестерин – для микоплазм
Никотиновая кислота или ее амид – для шигелл и
коринебактерий дифтерии,
Тиамин (В1) - для стафилококка, пневмококка,
бруцелл,
Пантотеновая кислота – для клостридий
столбняка, некоторых видов стрептококков,
Гемы – для гемофилов и микобактерий туберкулеза

7. Пути проникновения питательных веществ в бактериальную клетку

• Без затраты энергии (диффузия)
• простая
• Облегченная
• С затратой энергии
• активный транспорт = без химической
модификации переносимых молекул
• транслокация химических групп = с химической
модификацией переносимых молекул
п
е
р
м
е
а
з
ы

8. Дыхание бактерий

• = энергетический обмен веществ = цепь последовательных
окислительно-восстановительных реакций, сопровождающихся
переносом электронов от окисляющей системы к
восстанавливающей и катализируемых строго специфичными
ферментными системами.

9. Классификация бактерий по типу дыхания

1. Облигатные аэробы
2. Облигатные анаэробы
3. Факультативные анаэробы
Среди них выделяют:
А) Микроаэрофилы
Б) Капнеические

10.

11. Особенности метаболизма риккетсий, хламидий, микоплазм

• Риккетсии
Не способны синтезировать некоторые макромолекулы → облигатные
внутриклеточные паразиты
• Хламидии
• Не способны синтезировать некоторые макромолекулы →
облигатные внутриклеточные паразиты,
• Не способны синтезировать АТФ – «энергетические паразиты».
• Микоплазмы
Не способны синтезировать стерины для ЦПМ – «мембранные
паразиты».

12. Ферменты микроорганизмов

• белки, участвующие в метаболизме бактерий,
• распознают соответствующие им метаболиты, вступают с ними во
взаимодействие и ускоряют течение химических реакций
• НАПРИМЕР:
• Ферменты вирулентности (патогенности) – разрушают ткань и клетки,
обусловливая распространение бактерий и их токсинов в инфицированной ткани:
коллагеназа,
ДНКаза,
нейраминидаза,
лецитиназа и др.

13. Классификация бактериальных ферментов по механизму действия

1. Оксидоредуктазы (оксидазы, пероксидазы, каталазы, дегидрогеназы) – окислительновосстановительные ферменты,
2. Трансферазы – переносят отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим,
3. Гидролазы (эстеразы, фосфатазы, глюкозидазы) – ускоряют реакции гидролиза =
расщепление веществ на более простые с присоединением молекулы воды,
4. Лиазы (карбоксилазы) – отщепляют от субстратов химические группы
негидролитическим путем,
5. Изомеразы (фосфогексоизомераза) – превращают органические соединения в их изомеры,
6. Лигазы = синтетазы (аспарагинсинтетаза, глутаминсинтетаза) – ускоряют синтез
сложных соединений из простых.

14. Классификация бактериальных ферментов

• Экзоферменты
Синтезируются во внешнюю среду
• Конститутивные
Синтезируются постоянно (в том
числе и при отсутствии субстрата)
• Эндоферменты
Локализация:
• Периплазматическое пространство,
• ЦПМ,
• Цитоплазма.
• Индуцибельные
Синтезируются только при наличии
субстрата
Например: пенициллиназа –
синтезируется только при наличии
пенициллина

15. ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ

16. Требования к условиям культивирования бактерий

►1.Питательные потребности
• простые – растут на универсальных питательных средах
• сложные – растут на специальных питательных средах
►2.Температура культивирования
• мезофилы ≈ 37°С - бол-во патогенных бактерий,
• психрофилы - 6 – 20°С - возбудители чумы и лептоспироза,
• Термофилы - 50 – 60°С –актиномицеты, спороносные бациллы.
►3. Реакция среды (рН)
• нейтральная – большинство патогенных бактерий,
• кислая – ацидофилы (рН = 4,0-6,0),
• щелочная – алкалифилы ( для холерного вибриона рН = 7,8-8,6)

17. Требования к условиям культивирования бактерий

►4.Условия аэрации
не принимают во внимание – факультативные анаэробы,
↓ О2 – микроаэрофилы,
↑ СО2 – капнофилы,
без доступа воздуха – анаэробы,
с обязательным доступом воздуха – облигатные аэробы.
►5. Длительность культивирования - зависит от времени генерации,
- для большинства бактерий составляет 24-48 ч;
- некоторые растут дольше:
- бактерии коклюша – 2-5 сут,
- микробактерии туберкулеза – 3-4 нед.
►6. Освещение - например, микобактерии.

18. Питательные среды

А) должны содержать воду, т к все процессы осуществляются в воде,
Б) должны содержать органический источник углерода и энергии:
- органические соединения:
= углеводы (Глюкоза!),
= аминокислоты,
= органические кислоты,
= липиды,
- пептон= продукт неполного гидролиза белков, состоит из поли-, олиго- дипептидов,
В) должны
содержать:
- источники азота – пептон и соли аммония,
- серы - сульфаты,
- фосфора - фосфаты,
- микроэлементы = ионы кальция, магния, марганца, железа – соли (фосфаты)
Г) должны
обладать буферными свойствами = фосфатный буфер
или фосфатный буфер + карбонат кальция,
Д) должны
быть изотоническими – 0,87% хлорид натрия,
Е) должны быть стерильными.

19. Классификация питательных сред

по происхождению:
►Естественные – натуральные продукты животного, растительного или микробного
происхождения (молоко, сыворотка, кровь, картофель, морковь),
► Синтетические – химически чистые соединения в строго определенных концентрациях =
минимальные среды (основа: минеральные соли и глюкоза),
► Полусинтетические – минимальные среды, к которым добавлен пептон и дрожжевой
экстракт
по сложности изготовления:
►Простые – выпускаются промышленностью в сухом виде;
►основу их составляют пептоны – продукты ферментативного или кислотного гидролиза
белков животных и рыбы
►Н-Р: питательный бульон = ПБ или МПБ,
питательный агар = ПА или МПА,
►Сложные - готовятся на основе простых – добавляют:
1% сахара – сахарный агар,
10-20% сыворотки крови – сывороточный агар,
5-10% крови - кровяной агар.

20. Классификация питательных сред

по консистенции:
►Жидкие – мясной или рыбный бульон на дистиллированной воде,
- Н-Р, Питательный бульон =ПБ,
►Плотные – готовятся на основе жидких, добавляют 1,5% агар-агара (полисахарид, полученный из
морских водорослей), силикагеля или 10-15% желатины
- Н-Р,Питательный агар =ПА,
►Полужидкие – готовят на основе жидких, но агар-агара или силикагеля добавляют 0,7%, а желатины –
5-7,5%.
по назначению::
►Консервирующие – применяются для предотвращения отмирания бактерий в
патологическом материале,
Н-Р, Глицериново-солевая смесь,
►Основные – применяются для культивирования большинства бактерий,
- Н-Р, Питательные бульон и агар,
►Элективные (селективные)– обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного
вида бактерий,
- Н-Р, Желточно-солевой бульон для стафилококка,
желчный бульон для сальмонелл,
►Дифференциально-диагностические – применяются для изучения биохимических свойств
при идентификации бактерий,
- Н-Р, Среды Гисса, Ресселя, Эндо

21.

22. Характер роста бактерий на плотных питательных средах

Изолированная колония – не
Колония – видимое скопление
микроорганизмов, выросшее из одной
бактериальной клетки на плотной питательной
среде
соприкасается краями с другими
колониями

23. Характер колоний на плотных питательных средах

•S-форма колоний («гладкая»)
►Кокки,
►Грамотрицательные палочки, кроме Yersinia
pestis
•R-форма колоний («шероховатая»)
►Грамположительные палочки
►Yersinia pestis

24.

25. Характер роста бактерий на жидких питательных средах

•Диффузный рост (или помутнение) большинство бактерий,
•Плёнка – «коховские бактерии»,
•Придонный рост - клостридии,
•Пристеночный – стрептококки,
•Плёнка со спускающимися вниз
«сталактитами» – возбудитель чумы.

26.

Методы выделения чистых
культур аэробов

27. 1.Механическое разобщение клеток:

а) метод Коха:
- готовят десятикратные
разведения материала в
хлориде натрия,
- из каждого разведения 1 петлю
вносят в пробирку с агаром (400)
и выливают его в чашку Петри;

28. 1.Механическое разобщение клеток:

► б) метод Дригальского:
►1 петлю материала наносят на
поверхность агара в чашку
Петри и растирают шпателем,
► затем, не прожигая его,
растирают по поверхности
агара второй, а затем третьей
чашки и т.д;

29. 1.Механическое разобщение клеток:

в) метод истощающего
штриха

30. 1.Механическое разобщение клеток:

г) количественный метод Голда:
- 1 мл жидкого или 1 г твердого материала вносят в 9 мл NaCl,
- затем 1 петлю материала наносят на чашку = делают 40 штрихов (сектор А),
- задевая штрихи сектора А, проводят 4 штриха (1-й сектор),
- аналогично засевают 2-й и 3-й секторы

31. Методы выделения чистых культур аэробов

2. Предварительная обработка материала с помощью
физических или химических факторов:
Н-Р: 1) неспорообразующие бактерии уничтожают прогреванием при 80 0С 20
мин, споры при этом сохраняются;
2) для выделения микобактерий материал обрабатывают кислотой, при
этом сопутствующая флора погибает;
3. Избирательное подавление сопутствующих бактерий
физическими или химическими факторами во время инкубации
посевов.
Например: для выделений возбудителя чумы посевы инкубируют при Т=5 0
4. Заражение чувствительных животных = для выделения
возбудителя чумы из трупов грызунов

32. Методы выделения чистых культур аэробов

5. Использование
биологических свойств
бактерий:
Например: метод Шукевича для
выделения протея (ползучий
рост).

33. Методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий

►Физические
►Химические
►Биологические
►Метод Китта-Тароцци

34. Физические методы

1.Культивирование в специальных
приборах:
►анаэростате или газогенерирующей
камере - выкачивается воздух и
замещается инертным газом, например
азотом+5%углекислого газа и
10%водорода,
2. Использование трубки Виньяла-Вейона
= смешивание м/о с расплавленной и
охлаждённой питательной средой с её
последующим застыванием = глубинное
культивирование,

35. Физические методы

36. Химические методы

►А. Добавление в среду культивирования
химических веществ = поглотителей
кислорода = в замкнутом объёме
протекает химическая реакция с
поглощением кислорода:
►2 метода:
• метод Аристовского (сыпучие ингредиенты),
• метод Омелянского (жидкие ингредиенты).
►Б. включение в питательную среду
редуцирующих веществ (связывают
растворённый в среде кислород)
• глюкоза,
• тиогликолевая кислота и др.

37. Биологический метод

38. Метод Китта-Тароцци

39. Этапы бактериологического исследования

1. Забор материала
2. Транспортировка
3. Посев на плотные питательные среды для получения
изолированных колоний.
4. Выделение чистой культуры
5. Идентификация

40. 1. Забор материала

►а) выбор материала определяется клинической картиной:
- при заболеваниях верхних дыхательных путей – слизь из носа и зева,
мокрота;
- при заболеваниях желудочно-кишечного тракта – испражнения,
промывные воды, рвотные массы;
- при генерализованных формах – кровь;
►б) материал берут до начала лечения – антибиотики затрудняют
выделение;
► в) в разные стадии заболевания берут разный материал- н-р,
брюшной тиф
► г) материал берут асептически в стерильную посуду

41.

42. 2.Транспортировка

а) необходимы специальные
транспортные среды,
б) важно соблюдать условия
транспортировки:
- температура,
- влажность,
- время.

43. В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ 3. Посев материала на плотные питательные среды для получения изолированных колоний

44. 4.Выделение чистой культуры и накопление биомассы:

►4.1 . Изучение культуральных признаков
►4.2. Изучение морфологических и тинкториальных
(отношение к окраске) признаков = приготовление мазка и
окраска по Граму
► 4.3. Посев на скошенный столбик элективной питательной
среды
► 4.4. Проверка чистоты культуры = мазок, окраска по Граму

45. Культуральные признаки бактерий

►– это характер колоний на плотной питательной среде
Величина
Форма
Крупные, средние, мелкие
Круглые, овальные, розеткообразные, напоминающие
гриву льва, яичницу и т.п.
Цвет
Консистенция
Поверхность
Белые, желтые, красные, бесцветные
Сухие, влажные, слизистые
Гладкая, морщинистая, плоская, выпуклая
Край
Структура
Ровный, волнистый, фестончатый
Аморфная, зернистая, волокнистая

46. 5. Идентификация выделенной чистой культуры

►Это изучение биохимических и серологических свойств
бактерий:
►А) Определение сахаролитических ферментов
►Б) Определение протеолитических ферментов

47. Определение сахаролитических ферментов

►= посев на «пестрый ряд» (среды Гисса – включают в себя углевод и индикатор
Андреде).
►Для сбора газообразных продуктов в пробирки помещают поплавок.
►Различают:
- Короткий «пестрый ряд» включает углеводы: глюкоза, лактоза, мальтоза,
сахароза, маннит
- Длинный «пестрый ряд» включает те же углеводы, что и короткий ряд: глюкоза,
лактоза, мальтоза, сахароза, маннит и дополнительно в его состав входят:
►1) моносахариды: арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза;
►2) полисахариды: инулин, крахмал, гликоген;
►3) спирты: глицерин, дульцит, инозит

48. Определение сахаролитических ферментов

►I. Среды Гисса = «пестрый ряд»:
а - жидкая среда с углеводами и индикатором
Андреде;
б - полужидкая среда с индикатором ВР:
1 - микроорганизмы не ферментируют углевод;
2 - микроорганизмы ферментируют углевод с
образованием кислоты;
3 - микроорганизмы ферментируют углевод с
образованием кислоты и газа;
►II. - колонии микроорганизмов, не разлагающих
(бесцветные) и разлагающих лактозу
(фиолетовые на среде ЭМС - слева, красные на
среде Эндо - справа)

49. Определение сахаролитических ферментов

Принцип действия:
►утилизация содержащегося в среде углевода с образованием кислоты
сдвиг рН в кислую сторону
изменение цвета среды
►Разложение кислоты на газ и воду
Газ собирается в поплавке

50. Пестрый ряд для кишечной палочки

51. Определение сахаролитических ферментов - учет результатов:

1.Если цвет среды изменился, бактерии ферментируют этот углевод
до кислых продуктов (ставят в таблице букву К).
2. Если наряду с изменением цвета среды в поплавке обнаруживается
газ, бактерии ферментируют этот углевод до кислоты и газа (ставят
– КГ).
3. Если цвет среды не изменился, бактерии не ферментируют этот
углевод.

52. Определение протеолитических ферментов

= посев бактерий уколом в столбик 10-20% желатины и пептонную воду (в
пробирку к пробке прикрепляют индикаторные бумажки:
1. на индол = С8Н7N:
– Способ Эрлиха: в пробирку с культурой
добавляют 2-3 мл эфира и
А)реактив Эрлиха (спиртовый раствор парадиметил-амино-бенз-альдегид с
хлористоводородной кислотой
→встряхивают → розовое окрашивание,
Или:
Б) горячий насыщенный раствор щавелевой
кислоты → красное),

53. Определение протеолитических ферментов

2. сероводород – Н2S:
– бумажка, смоченная сульфатом железа → при выделении Н2S образуется
нерастворимый сульфит железа → черная окраска,
или:
- в пробирку с питательной средой добавляют смесь солей (сульфат железа,
тиосульфат натрия, сульфит натрия) и уколом засевают испытуемый штамм → по
ходу укола черное окрашивание,
-3. аммиак=N Н3 – лакмусовая бумажка.

54. Определение протеолитических ферментов - учет результатов:

1. При наличии протеолитических
ферментов бактерии разжижают
желатин, образуя «воронку» или
«елочку».
2. При образовании газообразных продуктов
разложения пептона бумажки меняют цвет:
бумажка на аммиак – синеет,
бумажка на сероводород - чернеет,
бумажка на индол – розовеет.
1 - формы разжижения желатина;
II - определение сероводорода;
III - определение индола:
1 - отрицательный результат;
2 - положительный результат

55. Определение наличия отдельных ферментов

►Для обнаружения каталазы на стекло
наносят культуру и каплю
1-3% р-ра Н2О2 → пузырьки газа.
Для обнаружения оксидазы на стекло
наносят культуру и каплю реактива,
Положительная оксидазная активность =
покраснение индикаторной бумажки

56. Определение гемолитической активности

►На кровяной агар засевают
культуру микроорганизма,
►Положительный результат =
вокруг колонии появляется зона
гемолиза

57. Ускоренные методы биохимической идентификации

А) СИБ = системы индикаторных бумажек
►= набор дисков, пропитанных
субстратами,
►их вносят в пробирки или на чашки
с чистой культурой, инкубируют 4
часа при 37о ,
►результаты учитывают по
изменению цвета бумажек.

58. Ускоренные методы биохимической идентификации

Б)набор мультимикротестов
►= пластиковые планшеты, в лунки которых
помещены субстраты с индикаторами,
► в лунки вносят бактерии,
► инкубируют 4 часа при 37о ,
►→ учитывают результаты по изменению
цвета.

59. РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ

►Рост – координированное воспроизведение всех клеточных
компонентов и структур, ведущее к увеличению массы клетки,
►- согласованное увеличение всех компонентов клетки.
►Размножение – увеличение числа клеток в популяции

60. Способы размножения бактерий

1. Бинарное деление –
► большинство бактерий,
► при благоприятных условиях происходит каждые 20 минут,
► процессу разделения клетки пополам предшествует период роста
цитоплазмы и репликации (=удвоения) ДНК,
2. Почкование
• Возбудитель туляремии,
• Микоплазмы,
• Дрожжи.
3. Фрагментация нитевидных форм
• Актиномицеты
• Микоплазмы
4. Экзоспоры
Стрептомицеты
5. Особый цикл деления
Хламидии

61. 1. Бинарное деление –

большинство бактерий,
при благоприятных условиях происходит каждые 20 минут,
процессу разделения клетки пополам предшествует период роста цитоплазмы и
репликации (=удвоения) ДНК:
Этапы:
►1. инициация – начало деления ДНК под действием репликона
информацию о дублировании;
►2.
элонгация – удлинение, рост цепи ДНК;
►3.
терминация – завершение роста цепи и спирализация ДНК.
= участка ДНК, содержащего

62. 1.Бинарное деление

►Параллельно с репликацией ДНК происходит рост
самой клетки,
►Расстояние между прикрепленными посредством мезосом к цитоплазматической мембране
двумя новыми ДНК постепенно увеличивается.
►Прокариотическая клетка начинает делиться:
► у грамположительных бактерий перегородка формируется от КС к центру клетки,
►У грамотрицательных - перетяжка
клетки (клетка истончается посередине).

63. Цикл развития хламидий

Стадия
Функция
Элементарной тельце
Инфекционная (проникновения в клеткухозяина путем инвагинации места
адсорбции)
Ретикулярное (инициальное)
тельце
Репродуктивная (размножение бинарным
делением → формирование
цитоплазматического включения –
микроколонии)
Промежуточное тельце
Переходная форма от ретикулярного тельца
вновь к элементарному тельцу

64.

65.

Стадии развития бактериальной популяции в
жидкой питательной среде

66. Стадии роста периодической бактериальной культуры

►Исходная
стационарная фаза
Деления клеток не
происходит

67. Стадии роста периодической бактериальной культуры

►Лаг-фаза
(=положительного
ускорения)
Скорость деления клеток
увеличивается

68. Стадии роста периодической бактериальной культуры

►Логарифмического
роста
(экспоненциальная)
Скорость деления клеток
максимальная

69. Стадии роста периодической бактериальной культуры

►Лог-фаза
(=отрицательного
ускорения)
Скорость деления клеток
снижается

70. Стадии роста периодической бактериальной культуры

►Стационарная фаза
максимума
Количество живых клеток
постоянно

71. Стадии роста периодической бактериальной культуры

►Ускоренной гибели
Количество живых клеток
начинает снижаться
(убывает с
увеличивающейся
скоростью)

72. Стадии роста периодической бактериальной культуры

►Логарифмической
гибели
Количество живых
клеток убывает с
максимальной
скоростью

73. Стадии роста периодической бактериальной культуры

►Уменьшения
скорости гибели
Количество живых клеток
убывает с
уменьшающейся
скоростью

74. Стадии роста периодической бактериальной культуры

►Стационарная фаза
минимума
Количество живых клеток
минимально

75. Некультивируемые формы бактерий

►В неблагоприятных условиях (в межэпидемический или межэпизоотический
периоды) неспорообразующие бактерии переходят в некультивируемое
состояние:
► бактерии сохраняют метаболическую активность (невысокий уровень), но не
способны к клеточному делению:
►клетки уменьшаются в размерах,
►приобретают сферическую форму,
►меняют вязкость ЦПМ,
►у них сохраняется транспорт электронов по дыхательной цепи.
►Факторы:
►температура,
►концентрация солей,
►уровень кислорода,
►содержание питательных веществ,
►метаболиты водорослей.
►При смене условий→ клетки приобретают способность к размножению и
восстанавливают свои свойства.