Сырьевые ресурсы биотехнологии

1. СЫРЬЕВЫЕ РЕСУРСЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Пред ферментационная стадия. Часть 1

2. Принципы организации биотехнологического процесса

1 Принцип экономической обоснованности
• Биотехнология внедряется только в те производственные процессы, которые нельзя
эффективно и с теми же затратами реализовать средствами традиционной технологии.
Например, аминокислоту лизин можно легко синтезировать химическим путем, но это
очень трудоемкая процедура, поэтому лизин получают путем микробиологического синтеза
2 Принцип целесообразного уровня технологических разработок
• Масштаб производства продукта, степень его очистки, уровень автоматизации – все это
должно определяться соображения экономической целесообразности, сырьевыми и
энергетическими ресурсами, уровнем спроса на готовый продукт.
• Например, для получения препаратом медицинского назначения, потребность в которых
составляет несколько килограммов в год, целесообразно получать в небольших
биореакторах, крупномасштабное производство здесь себя не оправдывает.
• В большинстве современных микробиологических производствах стремятся к
использованию чистых культур микроорганизмов и к полной стерильности оборудования,
сред, воздуха, но в некоторых случаях, продукт, удовлетворяющий потребителя (например,
биогаз). Получают без чистых культур, растущих в нестерильных условия.

3.

3 Принцип научной обоснованности
• Научные знания позволяют заранее провести расчет параметров
среды, конструкции биореактора и режима его работы
4 Принцип удешевления производства (максимальное снижении
затрат)
• Например, использование в биотехнологических процесса энергии солнца, естественных
биореакторов – природных водоемов вместо специальных сооружений для получения
биомассы водорослей
Двуедичная задача биотехнологии: создание оптимальных
условий для синтеза целевого продукта с использованием
биообъекта в максимально выгодном экономическом режиме при минимальных производственных затратах

4. Принципы подбора биотехнологических объектов

Вид – основная таксономическая единица, представляет совокупность
особей одного генотипа, обладающих хорошо выраженным
фенотипическим сходством. Вид подразделяют на подвиды или
варианты.
Штамм – более узкое понятие, чем вид. Это культуры одного вида.
Выделенные из разных природных сред (почв, водоемов, организмов
и др.). Разные штаммы одного вида могут отличаться по некоторым
признакам, например, чувствительностью к антибиотикам,
способностью синтезировать некоторые продуты метаболизма. Но эти
различия меньше, чем видовые.
Клон – совокупность потомков, выращенных из одной микробной
клетки.
Чистая культура – совокупность (популяция) микроорганизмов,
состоящая из особей одного вида

5. Выделение микроорганизмов

1 Отбираются пробы из мест, где обитание того или иного
продуцента наиболее вероятно.
• Например, углеводородокисляющие микроорганизмы
встречаются в почве бензоколонок, а винные дрожжи – на
винограде.
2 Образцы проб вносят в жидкие питательные среды специального
состава (элективные).
• В элективных средах путем варьирования различных факторов
создаются избирательные условия для преимущественного
развития определенного продуцента.
• Таким образом получают накопительные культуры
микрорганизмов

6.

• 3 Выделение чистых культур
• Для этого используют плотные питательные среды. На которые
засевают образцы проб из накопительных культур штрихом (для
получения изолированный колоний)
• Последующий пересев из изолированных колоний (после
анализа).
• Другой путь подбора микроорганизмов – из имеющихся
коллекций микроорганизмов.

7. Главный критерий при отборе продуцента – способность синтезировать целевой продукт

Требования к продуценту:
• Высокая скорость роста
• Использование для жизнедеятельности дешевых непищевых
субстратов
• Устойчивость к заражению посторонней микрофлорой
Все это позволяет значительно снизить затраты на производство
целевого продукта

8. Перспективные направления при выборе биообъекта

Фотосинтезирующие микроорганизмы
• Фототрофы перспективны как продуценты аммиака, водорода,
белка и различных биопрепаратов
Термофильные микроорганизмы (температура роста 60…80оС,
100оС и выше):
• снижение затрат для предотвращения контаминации (на
стерилизацию промышленного оборудования).
• Скорость роста и метаболическая активность выше в 1,5…2 раза
• Ценные продуценты спиртов, аминокислот, ферментов,
молекулярного водорода

9. Основная цель биотехнологии:

• Промышленное использование биологических процессов и
объектов на основе получения высокоэффективных форм
микроорганизмов, культур клеток и тканей растений и животных
с заданными свойствами, обеспечивающие получение целевого
продукта

10. Основные задачи пред ферментационной стадии

• Приготовление питательной среды (субстрата)
• Стерилизация питательной среды
• Подготовка воздуха (для аэробный процессов)
• Подготовка биореактора
• Получение посевного материала

11. Сырьевая база биотехнологии

Эффективность биотехнологических процессов достигается двумя путями:
• разработка и выделение новых высокопродуктивных биообъектов
• применение эффективных технологических режимов
С этой целью необходимо:
• подобрать подходящий субстрат (сырьё),
• разработать конструкцию аппарата,
• обеспечить автоматический контроль за протеканием биотехнологического
процесса,
• разработать способ выделения и очистки готового целевого продукта.
Причём, надо не только создать оптимальные условия для синтеза целевого
продукта, но и осуществлять производство в максимальном экономическом
режиме.

12. Питательные среды

это среды, содержащие различные
соединения сложного или простого
состава, которые применяются для
роста и размножения
микроорганизмов, а также культур
клеток сложных эукариотов
ТРЕБОВАНИЯ:
• Питательные вещества должны
быть в легко усвояемой форме;
Высокая буферная емкость ;
Изотоничность;
необходимы для:
• Стерильность;
• поддержания
оптимальных условий
для роста клеток (рН,
рO2, рСО2 и т.д.)
• обеспечения клеток
питательными
веществами для
синтеза биомассы.
• рН должна быть оптимальной для
клеток;
• Оптимальная влажность,
Вязкость,
12

13. Культивируемые биообъекты

Культуры
одноклеточных
микроорганизмов
Культивируемые биообъекты
• Автотрофы
Фототрофы (синезеленые бактерии и
др.)
Хемотрофы (Nitrobacter)
• Гетеротрофы
Прототрофы (кишечная палочка)
• Ауксотрофы (молочнокислые бактерии)
Культуры клеток многоклеточных организмов
Вирусы

14. В состав питательных сред для биотехнологических процессов входят:

Источники
углерода и
энергии
Углеводы (чистые и
углеводсодержащее сырье)
Минеральные
элементы
Ростовые факторы
Биохимические:
Макроэлементы
(N, P,K, Na и др.)
- аминокислоты, витамины и др.
- Кукурузный или дрожжевой экстракт
- Картофельный сок
Спирты
- Экстракт проростков ячменя и др.
Органические кислоты
Биофизические:
Углеводороды
Микроэлементы
- Температура культивирования
(Mo, V, Wo, Cs и др.)
- Интенсивное перемешивание,
обеспечивающее
необходимый массообмен

15.

• Питательный субстрат (питательная среда) является сложной трехфазной
системой, содержащей жидкие, твердые и газообразные компоненты.
• При выборе сырья учитывают не только физиологические потребности
выбранного продуцента, но и стоимость сырья
Содержание углерода, % от
содержания в глюкозе
Стоимость 1 т глюкозного
эквивалента, $
Кукурузный крахмал
100
64…91
Сахароза – сырец
105
629
Меласса
50
133
Уксусная кислота
100
140
Метан
180
105
Сырье

16. Важнейшие группы субстратов (технических источников углерода и минеральных веществ), используемых в биотехнологических

процессах
Чистые источники углерода и
азота
Сахара
Спирты
Органические кислоты
Парафины нефти
Природный газ
Технические источники углерода и азота
Меласса
Сок сахарного тростника
Гидролизаты растительный полимеров
Барда (кубовая часть брагоперегонки в производстве спирта)
Полупродукты – предшественники биотрансформации (соки растений)
Отходы сельскохозяйственной и лесной промышленности
Отходы промышленности, в т.ч. Переработки фруктов и овощей
Бытовые отходы, сточные воды
Вторичные материалы (молочная сыворотка)
Картофель, зерно
Зеленая биомасса растений

17. Традиционные источники углерода

Субстрат
Содержание
основного
вещества
Характеристика
Кристаллическая
глюкоза
99,5 %
Содержит зольные вещества ЗВ (0,07%), в т.ч. железа не более
0,0004%
Техническая
сахароза
99,75
Влажность до 0,15%, ЗВ не более 0,03%
Техническая
лактоза
92%
Влажность до 3%, ЗВ не более 2%, 1% молочной кислоты
Гидрол
70% (по РВ) в
пересчете на СВ
Сиропообразная жидкость, ЗВ до 7%, рН 4,0
Крахмал
СВ не менее 80%
ЗВ 1,2% в пересчете на СВ
Уксусная кислота
Не менее 60%
Содержит формальдегид и до 1,0% муравьиной кислоты
Узкая фракция
жидкого парафина
н-Алканы 87…93%
Содержит до 0,05% ароматических углеводородов и до 0,5% серы

18. Побочные продукты, используемые в биотехнологической промышленности в качестве основного сырья

Сырье
Использование
Сульфитный щелок
Производство кормовых дрожжей
Картофельная барда
Производство кормовых дрожжей
Зерновая барда
Производство дрожжей, антибиотиков, витамина В12
Гидрол
Культивирование дрожжей, бактерий, микромицетов
Солодовое сусло
Получение дрожжей (пекарских), этанола, ферментов
Молочная сыворотка
Производство кормовых дрожжей
Депротеинизированный сок растений
Производство хлебопекарный дрожжей,
антибиотиков
Гидролизат древесных отходов
Производство кормовых дрожжей, технического
этанола
Гидролизат торфа
Производство ферментов
Пшеничные отруби
Производство ферментов

19. Основ­ные принципы, лежащие в основе конструирования питательных сред

Основные принципы, лежащие в основе
конструирования питательных сред
• удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов;
• выбор сырьевых источников для конструирования ПС;
• дифференциация ПС по целевому назначению;
• оптимизация ПС;
• стандартизация ПС.

20. Удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов

• Основной принцип этого состоит в удовлетворении физиологических потребностей микроорганизмов.
Эти потребности, оптимальные значения рН и температуры указаны в специальных каталогах культур
и определителях.
• Количество необходимых азотосодержащих веществ определяют по содержанию азота в биомассе и
предполагаемого ее урожая, при этом следует иметь в виду, что около 5% азота остается не
использованным. Потребность в минеральном питании оценивают, культивируя микроорганизмы на
строго синтетических средах.
• Для ауксотрофных микроорганизмов необходимую концентрацию дефицитных факторов
подсчитывают с учетом потребностей выращиваемой культуры.
• В питательную среду необходимо вводить различные побочные ингредиенты, которые положительно
влияют на процесс ферментации (белки, аминокислоты, органические кислоты, минеральные
вещества и др.).
• Необходимо учитывать содержание потенциально вредных примесей (ингибиторов). Рост дрожжей
подавляется при концентрации (в %) щавелевой кислоты - 0,1; муравьиной - 0,2; уксусной - 0,2;
масляной - 0,05; меди - 0,005; серебра - 0,000001; мышьяка - 0,0005.
• Среда для выращивания клеток растений и животных, помимо многих указанных компонентов,
должна содержать специфические стимуляторы роста. Для клеток растений - это индолуксусная
кислота, кинетин и гиббереллиновая кислота. Клетки животных нуждаются в ростовых веществах и
незаменимых аминокислотах.

21. Химический состав микроорганизмов, % сухого вещества

Элемент или
соединение
Бактерии
Дрожжи
углерод
азот
кислород
водород
Р2О5
К2О
SO3
Nа2О
MgО
СаО
Fe2O3
SiO2
46,04
11,23
27,84
6,19
4,52
2,20
0,26
0,06
0,75
0,81
0,07
0,03
46,6
11,6
29,14
6,27
3,31
2,19
0,04
0,39
0,35
0,03
0,08

22. Вещества, избыток которых замедляет рост микроорганизмов

Вещество
Концентрация,
подавляющая рост
микроорганизмов, г/л
глюкоза
более 50,0
Аммиак
более 3,0
железо
более 1,15
магний
более 8,7
фосфор
более 10,0
цинк
более 0,038

23. Принципы подбора количества компонентов ПС для проведения биотехнологического процесса

• Используют данные химического состава биомассы
• Если культура синтезирует и выделяет в среду какой-либо продукт
(БАВ), следует учитывать и химический состав этого продукта.
• Поскольку гетеротрофы используют органические вещества не
только для построения своих клеточных структур, но и для
энергетического обмена, то учитывают и энергетический расход
компонентов ПС, который определяют по выходу АТФ.
• Определяют концентрацию ЛИМИТИРУЮЩЕГО компонента вещества, недостаток которого в ПС приводит к ограничению роста
культуры (например, глюкозное голодание → ррGрр → апоптоз)
• Остановка роста культуры м.б. как при недостатке, так и при
избытке субстрата в ПС

24. Выбор сырьевых источников для конструирования питательных сред

Сырье должно быть:
• полноценным (количественный и качественный состав сырья должен,
в основном, удовлетворять питательным потребностям микроорганизмов и клеток, для которых разрабатываются ПС);
• доступным (иметь достаточно обширную сырьевую базу);
• технологичным (затраты на внедрение в производство должны
осуществляться с использованием имеющегося оборудования или существующей технологии);
• экономичным (затраты на внедрение технологии при переходе на
новое сырье и его переработку не должны превосходить нормы затрат
для получения целевого продукта);
• стандартным (иметь длительные сроки хранения без изменения
физико-химических свойств и питательной ценности).

25. Дифференциация питательных сред по целевому назначению

По целевому назначению среды подразделяют:
• на микробиологические (предназначенные для культивирования бактерий, дрожжей,
грибов);
• среды для культур клеток, часть из которых относят также к вирусологическим средам.
По физическому состоянию ПС классифицируются на:
• жидкие – используют для исследований, их составом проще управлять
• жидкие концентрированные – для культивирования клеток в виде 10-, 50- и 100кратных концентратов
• полужидкие – добавляют 0,5 % агар – для культивирования анаэробных
микроорганизмов или при диагностике вирусов в чувствительных тканевых культурах
• твердые (плотные) – с использованием уплотняющих веществ (желатин, силикагель,
агар, карбоксилметилцеллюлоза и др.). Более удобны в транспортировке. На них легче
проводить микроскопическое изучение культур, легче выявить заражение посторонней
микрофлорой и выделить чистую культуру из отдельных колоний, для хранения
микроорганизмов.
• сухие - стандартны, хорошо хранятся и транспортируются, быстро растворяются в воде
при комнатной температуре. Их широко используют для получения диагностических ПС
По сложности:
• Простые
• сложные

26.

По происхождению:
• естественные (натуральные, комплексные);
• полусинтетические;
• синтетические
По набору питательных веществ выделяют:
• минимальные среды, которые содержат лишь источники питания, достаточные для роста;
• богатые среды, в состав которых входят многие дополнительные вещества.
В зависимости от назначения ПС различают:
• дифференциально-диагностические
• элективные
• селективные
• ингибиторные
• среды для поддержания культуры
• накопительные (насыщения, обогащения)
• консервирующие
• контрольные
По масштабам использования ПС подразделяются на:
• производственные (технологические);
• среды для научных исследований с ограниченным по объему применением

27. Оптимизация многокомпонентного состава питательной среды

Процессы культивирования микроорганизмов можно оптимизировать методами, которые
разделяются на две группы.
• К первой группе относятся методы оптимизации по экспериментальным данным. Они не
требуют привлечения сложных математических расчетов, но связаны со значительными
затратами времени, возникающими из-за необходимости проведения большого количества
экспериментальных исследований.
• Ко второй группе относятся методы с применением математических моделей. Являются
более точными, но более трудоемкими.
Задача оптимизации управляемого периодического процесса культивирования по
максимизации биомассы или целевого продукта в общем виде выглядит следующим образом:
определяется наиболее рациональный состав исходной ПС, а затем профили изменения
основных технологических параметров, обеспечивающих значение выбранного критерия
эффективности при заданных ограничениях.
Важнейшим элементом оптимизации технологического процесса является выбор критерия
эффективности. В качестве критериев используют такие показатели, как концентрация живых
микробных клеток, съем целевого продукта с единицы объема среды и т.д.
Сложности оптимизации ПС:
Большое количество и взаимосвязь составляющих ПС ингредиентов

28. Схема оптимизации ПС

Сбор предварительных данных о ПО и составе ПС
Выбор критерия оптимизации
Постановка эксперимента по матрице планирования
Получение обобщающей зависимости (модели)
Проверка адекватности модели и значимости коэффициентов
Оптимизация модели
Экспериментальная проверка расчетных концентраций
компонентов среды
Получение прописи оптимальной ПС

29.

Высоко объективным является метод балансировки состава ПС, в основу
которого заложено использование уравнения ассимиляции микробной
популяции, где учитываются такие показатели:
• концентрация потребляемого субстрата;
• время потребления;
• концентрация биомассы;
• коэффициент метаболизма;
• константы скорости образования и отмирания микроорганизмов;
• концентрация субстрата в начальный момент культивирования.
При подборе ПС для периодического культивирования возникает противоречие
между необходимостью внесения в нее достаточно большого количества
субстратов и ингибирующим влиянием высоких концентраций одного или
нескольких элементов питания на рост микробной клетки и(или) биосинтез
целевого продукта.
Снижение концентрации таких субстратов в исходной ПС с последующим их
добавлением в биореактор, по определенной программе, позволяет исключить
ингибирование процесса в начальной фазе роста и в то же время не допустить его
лимитирования в последующий период размножения микробов.

30. Стандартизация питательных сред

• Под стандартностью ПС принято понимать постоянство их состава по
биохимическим показателям: аминокислотному, минеральному,
жирнокислотному, углеводному составам, а также содержанию витаминов,
углеводородов, антибиотиков и др. компонентов.
• Большое значение для получения более стандартных ПС имеют разработки на
использование в их производстве сухих питательных основ, готовых сухих ПС
промышленного изготовления и сухих витаминсодержащих добавок.
Примером может служить технология изготовления сухого ферментативного гидролизата казеина неглубокой
степени расщепления, который широко используется при конструировании многих ПС, а также сухой экстракт
кормовых дрожжей.
• Работы, направленные на повышение стандартности ПС, могут приводить к их
удорожанию, но это считается оправданным, т.к. применение
разнокачественных сред может приводить к срыву еще более дорогостоящего
эксперимента, к появлению брака и к получению несопоставимых результатов.
• Создание и развитие системы оценки стандартности состава и свойств ПС,
оценка воспроизводимости технологии их приготовления являются как одними
из основных принципов конструирования ПС, так и передовыми задачами
развития микробиологии на современном этапе.