Воздействие смеси тяжелых металлов на функциональное состояние лабораторных животных

1.

Федеральный научный центр
Биологических систем и агротехнологий
Российской академии наук
Гос. тематика
№ 0526-2019-0001
Разработка фундаментальных
подходов к пород и кроссов,
мониторинга состояния
высокопродуктивных животных на
основе новых знаний о генотипе
животных с различным
метаболизмом и эффективностью
поддержания гомеостаза

2.

СОЧЕТАННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ
ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ
Pb
Cd
аддитивный
синергетический
Mn
2

3.

Цель исследования
Изучить комбинированное субхроническое воздействие смеси
тяжелых металлов на функциональное состояние лабораторных
животных
Задачи:
1) Оценить комбинированное субхроническое воздействие смеси тяжелых металлов
(Pb+Cd+Mn) на поведенческие реакции лабораторных животных;
2) Изучить биохимические и гематологические показатели крови лабораторных
животных на фоне комбинированного субхроническго воздействия смеси тяжелых
металлов (Pb+Cd+Mn);
3) Оценить содержание кальций-связывающего белка в сыворотке крови на фоне
комбинированного субхроническго воздействия смеси тяжелых металлов
(Pb+Cd+Mn);
4) Изучить валовое содержание химических элементов в сыворотке крови и головном
мозге на на фоне комбинированного субхроническго воздействия смеси тяжелых
металлов (Pb+Cd+Mn).
3

4.

Методика исследования
30 дней
Крысы линии Wistar (n=14)
Контроль (n=7)
ОР + вода
Опыт (n=7)
ОР + вода (Cd – 7,5 мг/мл,
Mn – 2,5 мг/мл, Pb – 25 мг/мл)
Еженедельно:
Оценка физических показателей: масса тела, потребление воды
Поведенческое тестирование: «Черно-белая камера», «Открытое поле»,
«тест Морриса»
В конце эксперимента:
Массовый коэффициент внутренних органов (сердце, печень, селезенка,
легкие, мозг)
Биохимический анализ крови
Морфологический анализ крови
Оценка содержания кальмодулина в сыворотке крови
Оценка валового содержания химических элементов в сыворотке крови и
головном мозге
4

5.

Физические показатели животных
Масса тела, г
Потребление воды лабораторными животными,
мл/сут (n=7 в каждой группе)
Группы
Количество
потребляемой
воды
Контроль
27,0 (25,0-34,0)
Опыт
20,0 (17,0-26,0)
Достоверность
р
0,03
Недели
Динамика массы тела лабораторных
животных в течение эксперимента
Массовые коэффициенты внутренних органов (n=7 в каждой группе)
Печень
Контроль
3,72 (3,6-3,86)
Опыт
4,08 (3,84-4,39)
Достоверность
р
0,03
Почки
0,77 (0,68-0,77)
0,76 (0,73-0,78)
0,7
Легкие
0,77 (0,64-0,97)
0,71 (0,55-0,88)
0,44
Мозг
0,8 (0,65-0,97)
0,83 (0,81-0,96)
0,6
Сердце
0,39 (0,35-0,48)
0,43 (0,4-0,48)
0,15
Селезенка
0,34 (0,26-0,37)
0,27 (0,25-0,29)
0,6
Органы
Группы
5

6.

Поведенческие реакции животных
*
Контроль
Опыт
**
Кол-во актов
Кол-во пересеченных квадратов
тест «Открытое поле»
*
**
ГДА (периф.)
ГДА (2/3) ГДА (центр.) ГДА (сум.)
Груминг (кор.) Груминг (длин.) Груминг (сум.) Дефекация
Горизонтальная двигательная активность
лабораторных животных
Показатели груминга и актов дефекации
лабораторных животных
тест «Черно-белая камера»
Результаты тестирования «Черно-белая камера» (n=7 в каждой группе)
Показатели
Черный отсек (сек)
Белый отсек (сек)
Число выглядываний
Группы
Контроль
168,0 (160,0-180,0)
12,0 (0,0-20,0)
1,0 (0,0-2,0)
Опыт
171,0 (165,0-180,0)
9,0 (0,0-15,0)
2,0 (0,0-4,0)
Достоверность
р
0,654721
0,654721
0,482203
6

7.

Клинический анализ крови
Морфологические показатели крови (n=7 в каждой группе)
Группы
Показатели
Контроль
10,8 (9,98-11,84)
26,0 (21,0-27,5)
66,9 (65,5-69,1)
3,3 (2,0-4,3)
1,7 (1,6-2,1)
0,9 (0,5-1,1)
8,45 (8,42-8,56)
143,0 (141,0-144,0)
494,0 (460,0-585,0)
WBC, 109/л
Neo, %
Lym, %
Mon, %
Eos, %
Bas, %
RBC, 1012/л
HGB, г/л
PLT, 109/л
Достоверность
Опыт
9,38 (9,02-10,21)
30,1 (23,2-33,9)
60,1 (58,8-71,8)
2,6 (1,6-4,7)
2,2 (1,5-3,0)
0,9 (0,8-1,1)
7,67 (7,27-8,25)
134,0 (129,0-134,0)
509,0 (460,0-615,0)
р
0,67
0,53
0,53
1,0
0,75
0,91
0,05
0,01
0,93
Биохимические показатели крови (n=7 в каждой группе)
Показатели
Глюкоза, ммоль/л
Общий белок, г/л
Альбумин, г/л
АЛТ, Ед/л
АСТ, Ед/л
Билирубин общий, мкмоль/л
Холестерин, ммоль/л
Триглицериды, ммоль/л
Мочевина, ммоль/л
Креатинин, мкмоль/л
Группы
Контроль
7,8 (6,4-8,3)
71,3 (69,9-75,6)
32,0 (31,0-36,0)
130,4 (90,4-173,4)
487,0 (334,5-524,9)
3,5 (2,7-4,1)
1,76 (1,45-2,4)
0,09 (0,08-0,53)
5,4 (4,6-7,2)
63,3 (52,8-65,0)
Опыт
6,6 (3,63-7,03)
68,6 (68,5-70,8)
33,0 (34,0-35,0)
140,0 (136,6-160,3)
520,2 (319,0-532,9)
3,31 (2,9-3,59)
1,45 (1,4-1,98)
0,12 (0,1-0,46)
6,4 (6,2-8,5)
60,1 (55,20-62,5)
Достоверность
р
0,23
0,25
0,55
0,55
1,0
0,76
0,45
0,37
0,02
0,65
7

8.

Валовое содержание химических элементов
Сыворотка крови
**
мкг/л
мкг/л
мкг/л
*
Pb
Сd
Головной мозг
Pb
нг/г
нг/г
Опыт
(Сd+Mn+Pb)
*
нг/г
Контроль
Mn
Сd
Mn
8

9.

Выводы
Внутреннее
воздействие
Pb
снижение потребления
воды
повышение
тревожности
увеличение МК печени
увеличение
двигательной активности
снижение уровня
эритроцитов, гемоглобина
снижение
исследовательской
активности
повышение уровня
мочевины
Cd
Mn
Внешнее
воздействие
повышение уровня
Pb, Cd, Mn
в головном мозге
уровень
кальмодулина
повышение уровня
Pb, Cd, Mn
в сыворотке крови
ухудшение
когнитивных функций
Поведенческие
исходы
мозг
9

10.

Особенности биогеохимических
провинций
10

11.

Цель исследования
Изучить элементный состав шерсти коров голштинской породы из трёх
областей России (Вологодская, Ленинградская и Оренбургская области).
Материалы и методы
Коровы голштинской породы
(n=75)
1 ГРУППА (n=25)
2 ГРУППА (n=25)
3 ГРУППА (n=25)
Вологодская область
СПК ПКЗ «Вологодский»
Ленинградская область
АО ПЗ «Первомайский»
Оренбургская область,
Агрофирма «Промышленная»
Оценка уровня химических элементов в шерсти методом МС-ИСП
Ленинградская область
Вологодская область
Вологодская и Ленинградская
области входят в состав
Северо-Западного
федерального округа и
территориально удалены от
Оренбургской области,
входящей в Приволжский
федеральный округ
Оренбургская область
11

12.

Результаты
Элемент
Ca
K
Mg
Na
P
Co
Cr
Fe
Cu
I
Mn
Se
Zn
Li
B
Ni
Si
V
As
Cd
Sn
Sr
Pb
1 группа
(Вологодская область)
2 группа
3 группа
(Ленинградская область)
(Оренбургская область)
Макроэлементы
2468 (1301-2949) a b
1309 (830-2408) c
3493 (1937-4247)
a
b
c
4271 (3630-5628)
6237 (5471-7094)
2092 (1585-2485)
a
b
c
582 (281-760)
347 (229-551)
757 (617-953)
1488 (1254-1641) a b
2302 (1825-2722) c
666 (518-1 012)
255 (222-295) b
274 (247-300) c
214 (191-234)
Эссенциальные элементы
0,035 (0,024-0,062) а b
0,018 (0,011-0,021) c
0,312 (0,264-0,414)
b
c
0,168 (0,135-0,234)
0,061 (0,055-0,088)
1,750 (1,280-2,210)
129 (52,2-203) a b
41,7 (30,1-58,6) c
695 (535-1 073)
a
c
8,15 (7,61-8,67)
9,28 (8,42-10,26)
8,35 (7,78-9,01)
a
b
c
2,05 (1,54-3,47)
0,93 (0,63-1,09)
0,65 (0,47-0,91)
3,13 (2,27-4,06) b
2,17 (1,94-2,73) c
29,62 (25,90-42,72)
0,76 (0,53-0,86) b
0,60 (0,48-0,79)
0,54 (0,42-0,66)
113 (103-141) b
119 (108-128) c
173 (137-213)
Условно-эссенциальные элементы
a
b
0,32 (0,29-0,41)
0,18 (0,12-0,22) c
0,58 (0,41-0,76)
8,7 (2,64-10,43) a
1,93 (1,12-5,99) c
5,80 (3,30-7,16)
a
b
c
0,178 (0,126-0,265)
0,105 (0,079-0,147)
1,520 (1,210-1,940)
a
b
c
2,3 (1,4-3,8)
3,8 (2,7-5,8)
7,8 (4,9-11,3)
0,034 (0,021-0,045) a b
0,018 (0,014-0,024) c
1,330 (1,080-1,610)
Токсичные элементы
0,143 (0,112-0,185) a b
0,030 (0,023-0,042) c
0,215 (0,176-0,279)
a
b
c
0,0058 (0,0021-0,0129)
0,0021 (0,0010-0,0032)
0,0219 (0,0183-0,0357)
b
c
0,0060 (0,0032-0,0235)
0,0069 (0,0047-0,0104)
0,0219 (0,0147-0,0331)
5,26 (2,80-7,44) a b
2,19 (1,38-2,92) c
14,85 (8,93-20,96)
b
c
0,053 (0,042-0,090)
0,068 (0,041-0,088)
0,8490 (0,4760-1,340)
35
30
25
20
15
10
5
0
1
2
3
Увеличение Mn в
шерсти коров
Оренбургской области в
среднем на 11,4%
Примечание: а – P≤0,05 при сравнении 1 группы со 2 группой; b – P≤0,05 при сравнении 1 группы с 3 группой
c – P≤0,05 при сравнении 2 группы с 3 группой
12

13.

Spesiation analysis Mn-фракций
13

14.

Цель исследования
изучение видового анализа марганца у коров голштинской породы c различным
уровнем содержания марганца в сыворотке крови
Материалы и методы
Коровы голштинской породы
(n=75)
Из общего числа животных выделили коров с низконормальными значениями и
высоконормальными значениями
1 ГРУППА (n=17)
2 ГРУППА (n=20)
Низконормальные значения Mn
(концентрация Mn до 25-го процентиля)
Высоконормальные значения СПК
(концентрация Mn выше 75-го процентиля)
Определение общего содержания микроэлементов в крови методом МС-ИСП
Speciation analysis Mn-фракций в крови методом МС-ИСП + ВЭЖХn
14

15.

Материалы и методы
Методика определения общего содержания микроэлементов в крови
Определение содержания элементов в образцах
сыворотки крови проводили методом массспектрометрии с индуктивно связанной плазмой
(ICP-MS) с использованием масс-спектрометра
NexION 300D (PerkinElmer Inc., США). Элементный
состав сыворотки крови изучали по 24 параметрам
(As, B, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, I, K, Li, Mg, Mn, Na, Ni,
P, Pb, Se, Si, Sn, Hg, Sr, V, Zn).
Условия и параметры сбора данных
NexION 300D
Описание
Расход газа в распылителе, Л/мин
Расход плазменного газа, Л/мин
Расход вспомогательного газа, Л/мин
Мощность ICP RF, Вт
Расход газа в камере (аммиак), Л/мин
Сэмплер
Расход пробы, мкл/мин
Внутренний стандартный расход,
мкл/мин
RPa
RPq
Стандартный
режим
0.88
17
1.3
1350
Платина
637
Режим
DRC
0.88
17
1.3
1350
0.55
Платина
637
84
84
-
0
0.9
Элементные изотопы, значения пределов обнаружения
(LOD) и пределов количественной оценки (LOQ)
Элемент
Режим
As
B
Ca
Cd
Co
Cr
Cu
Fe
Hg
I
K
Li
Mg
Mn
Na
P
Pb
Se
Si
Sn
Sr
V
Zn
Стандарт
Стандарт
DRC
Стандарт
DRC
DRC
Стандарт
DRC
Стандарт
Стандарт
DRC
Стандарт
DRC
DRC
DRC
Стандарт
Стандарт
DRC
Стандарт
Стандарт
Стандарт
DRC
Стандарт
Mass
(amu)
75
10
43
111
59
54
65
57
202
127
39
7
25
55
23
31
208
77
29
120
88
51
67
LOD
(ppb)
0.001
0.070
0.117
0.002
0.001
0.023
0.003
0.079
0.012
0.008
0.291
0.002
0.239
0.010
4.26
3.35
0.001
0.0002
0.013
0.324
0.001
0.0004
0.0003
LOQ
(ppb)
0.004
0.234
0.340
0.005
0.004
0.076
0.012
0.264
0.041
0.025
0.968
0.008
0.795
0.034
14.2
11.2
0.002
0.0005
0.043
1.08
0.004
0.0012
0.0009
15

16.

Материалы и методы
Speciation analysis Mn-фракций в крови
Анализ форм марганца был выполнен посредством разделения сыворотки крови на
фракции с последующим определением содержания металла в каждой фракции
методом ИСП-МС. Для определения форм связывания марганца в сыворотке
крови в качестве элемент-специфического детектора был использован ИСП-МС
NexION 300D. Условия эксплуатации прибора были такими же, как и при
определении общего содержания металлов в сыворотке крови.
Разделение проводили с помощью системы для высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) компании PerkinElmer (Series 200). Для
разделения форм марганца использовали метод эксклюзионной хроматографии.
Для оптимизации процесса разделения соединений сыворотки крови ВЭЖХсистема была оснащена хроматографическими колонками двух типов, что
позволило
улучшить
степень
разделения
высокомолекулярных
и
низкомолекулярных соединений. Для разделения высокомолекулярных соединений
была использована хроматографическая колонка Agilent Bio SEC-5 (7.8 × 300 mm) с
размером пор 300 Å. Вторая колонка Agilent Bio SEC-5 (7.8 × 150 mm) с размером
пор 130 Å применялась для деления низкомолекулярных компонентов.
16

17.

Результаты
Группа
Элемент
I (низконормальные)
II (высоконормальные)
Макроэлементы, мг/л
Ca
73.5 (72.9-75.5)
85.2 (84.1-91.17)b
K
184 (174-201)
199 (184-203.5)
Mg
24.8 (23.7-26.1)
29.3 (27.1-30.6)
Na
2 937 (2 803-3 070)
3 162 (3 078-3 243)
P
195 (167-240)
262 (223-289)
Жизненно необходимые микроэлементы, мкг/л
Co
0.45 (0.39-0.46)
0.61 (0.55-0.67)
Cr
1.7 (1.6-1.8)
1.7 (1.62-1.8)
Fe
1480 (1350-2010)
2020 (1850-2270)
Cu
543 (504-568)
750 (690-840)a
I
79.6 (67-129)
101 (88-143)
Se
49 (40-51)
67 (61-75)a
Zn
664 (521-798)
973 (882-1065)
Li
56 (55-57)
64 (60-70)
Условно жизненно необходимые микроэлементы, мкг/л
B
277 (269-308)
262 (226-299)
Ni
4.7 (3.5-6.7)
3.5 (3.0-4.9)
Si
172 (156-199)
212 (198-216)
V
2.5 (2.4-2.6)
3.1 (2.9-3.4)b
As
9.0 (8.5-9.2)
9.05 (8.65-9.6)
Потенциально токсичные и токсичные микроэлементы, мкг/л
Cd
0.012 (0.11-0.13)
0.12 (0.11-0.13)
Sn
1.1 (1.0-1.15)
1.2 (1.1-1.3)
Sr
88.4 (82.4-116)
111 (105-119)
Pb
0.53 (0.36-0.54)
0.64 (0.55-0.91)
Hg
0.9 (0.8-0.96)
0.9 (0.85-0.93)
Содержание
микроэлементов в
сыворотки крови коров
голштинской породы,
разделённых в
зависимости от общего
уровня содержания
марганца в крови
Низконормальные
Mnобщ= 1.7 (1.6-1.9) мкг/л
Высоконормальные
Mnобщ= 3.1 (2.92-3.65) мкг/л
Примечание:
a p ≤ 0.05 – при сравнении II группы
относительно I группы ; b p ≤ 0.01 –
при
сравнении
II
группы
относительно I группы: Mnобщ –
общая концентрация марганца в
сыворотке крови
17

18.

Результаты
Однако, несмотря на практически полное отсутствие, статистически значимых различий между
группами при сравнении результатов общей концентрации микроэлементов, анализ
видообразования выявил значительное влияние концентрации марганца на его фракции.
Лабораторные хроматограммы ВЭЖХ-ICP MS для форм Mn в сыворотке крови (I) и
переломов пика (II)
Примечание: (I) - Базовая линия 1, 2, 3' – базовые сигналы разных животных похожи, но во избежание перекрытия
положения разделили их на графике. II) хроматограммы пиковых значений фракций 1 (680-920 кДа), 2 (250-370 кДа), 3 (160200 кДа), 4 (65-80 кДа), 5 (300-1400 Да) и 6 (30-70 Да))
18

19.

Результаты
Концентрация предполагаемых фракций марганца на фоне различного его
содержания в сыворотке крови коров голштинской породы, мкг/л
Группа
Номер
фракции
Диапазон
молекулярных
масс
Предполагаемые фракции марганца
1
680-920 кДа
2
I группа
(низконормальные)
II группа
(высоконормальные)
α2-макроглобулин (тетрамер) (Mn-A2М(4))
0.229 (0.198-0.262)
0.14 (0.11-0.17)b
250-370 кДа
α2-макроглобулин (димер) (Mn-A2М(2))
0.063 (0.041-0.08)
0.07 (0.05-0.09)
3
160-200 кДа
α2-макроглобулин (мономер) (Mn-A2М(1))
0.056 (0.045-0.079)
0.73 (0.69-0.75)b
4
Трансферрин/альбумин (Mn-Tf/Alb)
0.110 (0.103-0.114)
0.56 (0.52-0.61)b
5
65-80 кДа
300-1400 Да
Цитрат (Mn-Cit)
0.056 (0.044-0.071)
0.26 (0.25-0.27)b
6
30-70 Да
«Свободный» марганец (Mn-free)
0.791 (0.748-0.912)
1.39 (1.30-1.46)b
Примечание: a p ≤ 0.05 – при сравнении II группы относительно I группы; b p ≤ 0.01 – при сравнении II группы
относительно I группы; Mnобщ – общая концентрация марганца в сыворотке крови
19

20.

Результаты
Для наглядности на рисунке представлены результаты анализа процентного распределения
марганца по фракциям на фоне его различного содержания в сыворотке крови.
Процентное распределение марганца по фракциям на фоне его различного
содержания в сыворотке крови коров голштинской породы, %
Примечание: a p ≤ 0.05 – при сравнении II группы относительно I группы; b p ≤ 0.01 – при сравнении II группы
относительно I группы.
Иерархия концентраций в зависимости от уровня марганца в крови:
1 группа (↓ Mn): Mn-free >> Mn-A2M(4) >> Mn-Tf/Alb >> Mn-A2M(2) >> Mn-A2M(1) >> Mn-Cit
2 группа (↑ Mn): Mn-free >> Mn-A2M(1) >> Mn-Tf/Alb >> Mn-Cit >> Mn-A2M(4) >> Mn-A2M(2)
20

21.

Результаты
Взаимосвязь между различными формами марганца и его общей концентраций у
коров голштинской породы
Низконормальные
Mnобщ= 1.7 (1.6-1.9) мкг/л
Высоконормальные
Mnобщ= 3.1 (2.92-3.65) мкг/л
Mn-A2M(4) = 0,0383+0,1436*x; Mn-A2M(2) = 0,1440,062*x; Mn-A2M(1) = 0,15-0,0687*x; Mn-Tf/Alb = 0,11450,0028*x; Mn-Cit = -0,0544+0,088*x; Mn-free = 0,3857+0,8972*x;
Mn-A2M(4) = -0,3783+0,1698*x; Mn-A2M(2) = 0,20770,0438*x; Mn-A2M(1) = 0,6441+0,0246*x; Mn-Tf/Alb =
0,0527+0,1576*x; Mn-Cit = 0,3433-0,0275*x;Mn-free = 0,8695+0,7193*x;
R2=0,9; p≤0.05
R2=0,9; p≤0.05
21

22.

Результаты
Полученные данные были
опубликованы в журнале BioMetals.
Авторитетный журнал, освещающий
важную роль ионов металлов в химии,
биологии, биохимии, экологии и медицине
22

23.

Показатели публикационной активности сотрудников за 2022 год по теме
№ № 0526-2019-0001
№
Выполнение 100%
ФИО
1 Нотова С.В. (совм)
2 Скальный А.В. (совм)
3 Тяпугин Е.А. (совм)
5 Тиньков А.А. (совм)
6 Айсувакова О.П. (совм)
7 Казакова Т.В.
8 Маршинская О.В.
9 Тарасова Е.И.
10 Кияева Е.В. (совм)
11 Платонов С.А.
12 Петруша Ю.К.
13 Мифтахова А.М.
14 Мирошникова К.П.
Всего по теме
Количество баллов
Запланировано Выполнено
0,5
4,58
0
0
0,9
0
0,9
4
1,5
4,58
1,5
4,58
1,5
0
0,5
0
0,25
0
0,25
0
0,125
0
0,125
0
8,05
17,74
Патент: «Способ отбора особей крупного рогатого скота с высоким уровнем
Ca и Mn и молочной продуктивностью по полиморфизму гена LRP4»
23

24.

Спасибо за внимание!
24