Основы молекулярной биологии. Микроскопия

1.

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
Основы молекулярной биологии
Микроскопия

2.

Методы микроскопии
2

3.

Микроскопия видимого света
3

4.

Микроскопия видимого света
дифференциальноинтерференционная
контрастная
микроскопия
поляризованный
свет
4

5.

Фазово-контрастная микроскопия
https://intergen.ru/blog/fazovo-kontrastnaya-mikroskopiya
5

6.

Дифференциально-интерференционная
контрастная микроскопия
https://www.microsystemy.ru/info/articles/metody-kontrasta-v-svetovoy-mikroskopii-ichast/
6

7.

Микроскопия видимого света
(а) Светлопольная микроскопия.
(б) Фазово-контрастная микроскопия.
(в) Дифференциальная интерференционная контрастная
микроскопия.
(г) Микроскопия темного поля
Альбертс Б. и др. Молекулярная биология клетки
7

8.

Микроскопия видимого света
8

9.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия
9

10.

Конфокальная флуоресцентная микроскопия
10

11.

Методы введения флуоресцентных меток
Флуоресцентные антитела
(фиксированные клетки или образцы тканей)
11

12.

Методы введения флуоресцентных меток
Низкомолекулярные флуорофоры
DAPI
Окраска ДНК
Fura-2
Индикатор кальция
12

13.

Методы введения флуоресцентных меток
Синий: DAPI (ДНК)
Зелёный: FITCмеченые антитела к
тубулину (компонент
микротрубочек)
Красный: Alexa 568меченый фаллоидин
(связывает актиновые
филаменты)
FITC –
флуоресцеинизотиоцианат
фаллоидин
13

14.

Методы введения флуоресцентных меток
В белки в живых клетках
Ген целевого белка
Добавляем последовательность,
кодирующую флуоресцентный белок к
последовательности целевого белка
Экспрессия белка, «сшитого» с
флуоресцентным белком в живой
клетке
14

15.

Флуоресцентные белки
Green fluorescent protein (GFP)
...
O
NH
...
O
NN
NH
OH
N
HN
HO
O
NH...
OH
OH
O
O
...
Созревание хромофора из
аминокислот
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien
Nobel Prize 2008
Aequorea victoria
15

16.

Натуральные флуоресцентные белки
16
https://www.physiology.org/doi/full/10.1152/physrev.00038.2009

17.

Искусственные флуоресцентные белки
17
https://www.physiology.org/doi/full/10.1152/physrev.00038.2009

18.

Методы введения флуоресцентных меток
в РНК в живых клетках
18

19.

Флуоресцентная гибридизация in Situ (FISH)
Fluorescence in Situ Hybridization (фиксированные клетки)
19
https://www.creative-diagnostics.com/in-situ-hybridization-and-fluorescence-in-situ-hybridization.htm

20.

Флуоресцентная микроскопия
20

21.

Multiplexed error-robust
FISH (MERFISH)
Позволяет идентифицировать от 100 до 1000
различных РНК в одной клетке
21
https://www.science.org/doi/10.1126/science.aaa6090

22.

Резонансный перенос энергии (FRET)
Förster resonance energy transfer
k ~ 1/r6
Эффективность FRET чувствительна к
расстоянию между флуорофорами
22

23.

Флуоресцентный клеточный сортер (FACS)
Fluorescently activated cell sorter
laser
detector
electric charging
++
+
Red (old)
timer
Blue (new)
timer
23

24.

Микроскопия сверхразрешения
Проблема дифракционного предела в микроскопии
Разрешение микроскопа ограничивается радиусом диска Эйри
24

25.

Микроскопия структурированного освещения (SIM)
Structured Illumination Microscopy
Конфокальная
микроскопия
SIM
Структурированный свет
25

26.

Микроскопия на основе подавления
спонтанного испускания (STED)
Stimulated emission depletion
Возбуждение
50 пс (558 нм)
Флуоресценция
STED
1000 пс
200 пс (763 нм)
Разрешение можно регулировать
интенсивностью STED-пучка 26

27.

Микроскопия стохастической оптической реконструкции (STORM)
Stochastic optical reconstruction microscopy
Фотоактивируемая локализационная микроскопия (PALM)
Photo-activated localization microscopy
Последовательно точечно возбуждают малую часть флуорофоров и
регистрируют разнесенные в пространстве сигналы
! Разрешение достигает 10 нм
27

28.

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего
отражения (TIRF)
Total internal reflection fluorescence
Динамика GFP-актина во время эндоцитоза
28

29.

Электронная микроскопия
пучок электронов
29

30.

Просвечивающая электронная
микроскопия
Позитивное окрашивание
Негативное окрашивание
Клетки Vero, зараженные
ортопоксвирусом
Семь частиц аденовирусов и множество
частиц аденоассоциированных вирусов
! Разрешение достигает 0,04 нм
30

31.

Просвечивающая электронная
микроскопия
31

32.

Сканирующая или растровая электронная
микроскопия
Микрофотография пыльцы
! Разрешение достигает 0,4 нм
32

33.

Крио-электронная томография
Реконструкция вириона ВИЧ
33

34.

Криоэлектронная микроскопия
34

35.

Криоэлектронная микроскопия
35

36.

Криоэлектронная микроскопия
36

37.

Криоэлектронная микроскопия
37

38.

Криоэлектронная микроскопия
38
Структура ГАМК рецептора с разрешением 1,7Å