Молекулярна біологія вірусів

1.

МОЛЕКУЛЯРНА БІОЛОГІЯ ВІРУСІВ
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

2.

МОЛЕКУЛЯРНА БІОЛОГІЯ ВІРУСІВ
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

3.

МОЛЕКУЛЯРНА БІОЛОГІЯ ВІРУСІВ
NB
SL
MD
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University
AH

4. Основні властивості вірусів

Можливість фільтрації через бактеріальні фільтри;
Існування у вірусів одного типу нуклеїнової
кислоти (або ДНК або РНК);
Відсутність властих білок — синтезуючих систем;
Внутрішньоклітинний паразитизм
Відсутність росту та диз’юнктивний спосіб збірки
НЕКЛІТИННІ ФОРМИ ЖИТТЯ!!!
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

5.

Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

6. Визначення

“Віруси– облігатні внутрішньоклітинні паразити або
симбіонти, які мають власні геноми, що кодують
інформацію, необхідну для вірусної репродукції, і
відповідно, мають певну супінь автономії від генетичних
систем хазяїна, - але не кодують всю систему трансляції
та мембранного апарату.
(E. Koonin, 2012; Є. Кунін, 2014)
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

7. Дві прості речі, які слід завжди пам’ятати щодо вірусів

1. Можливий будь-який варіант запису
генетичної інфомації ( РНК, ДНК, 1л, 2л,
фрагментовна, амбісенсова etc)
2. АЛЕ РЕАЛІЗУВАТИ ГЕНЕТИЧНУ
ІНФОРМАЦІЮ ВІРУС МОЖЕ ТІЛЬКИ ЗАВДЯКИ
КЛІТИНИМ МЕХАНІЗМАМ. (незалежно від
варіанту запису генетичної інформації вірусів
необхідна поява “стандартної” мРНК для
синтезу білку………)
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

8. Широкогеномний RNAi скринінг для пошуку клітинних факторів репродукції вірусу грипу

Виявлено 295 клітинних кофакторів, задіяних у
ранній реплікації вірусів грипу. Крім цієї групи
виявлено: фактори, що включені у кіназрегулюючу передачу сигналу, убіквітазну та
фосфатазну активність та 181 група факторів, що
задіяні у високо-специфічну взаємодію вірусгосподар. Більше того, було підтверджено, що 219
з 295 факторів є необхідними для ефективного
росту вірусів грипу дикого типу (4266 взаємодій
між вірусними чи клітинними білками) .
Nature February 2010
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

9. Деякі основні питання молекулярної біології вірусів:

- Механізми транскрипції вірусів та
трансляції вірусних білків
- Механізми реплікації вірусів
- Молекулярні основи вірус-клітинних
взаємодій
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

10.

Механізми транскрипції
вірусів
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

11. Транскрипція і трансляція в прокаріотах

Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

12. Білок-ДНКові взаємодії

Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

13. Simple and complex DNA – dependent RNA polymerases

Viral RNA polymerases (1 subunit)
Prokaryotic RNA polymerases (4 different subunits)
Eukaryotic and archeal RNA polymerases (at least 12
subunits)
Viruses
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

14. Етапи транскрипції

Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

15. Ініціація транскрипції

Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

16.

Субодиничний склад бактеріальної РНК-полімерази
РНК полимераза
’
Core-фермент
40kD
155kD
’ 160kD
Факторы инициации
70
20
28
32
54
22
kD
kD
kD
kD
kD
kD
основная
транспорт железа
флагелла
тепловой шок
метаболизм азота
тепловой и
окислительный шок
38 kD ? экспрессия каталазы,
эндонуклеазы III
Ассоциированные факторы
NusA
55kD
фактор элонгации, паузы,
антитерминация N, аттенюация,
котранскрипционное сворачивание
РНК
NusG
21kD фактор элонгации, супрессирует
паузы, антитерминация N
GreA
18kD
разрезание транскрипта 2-3н. в
“арестованных” комплексах
GreB
19kD
разрезание транскрипта до 9н. в
“арестованных” комплексах
Mfd
130kD освобождение РНК полимеразы,
(TRCF)
блокированной тиминовым димером,
активация UvrABC
Фактор терминации
47 kD, гексамер
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

17. Послідовність подій ініціації транскрипції

-35
TTGACA
-10
промотор
TATAAT
’
’
’
’
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

18.

Промоторні області, що пізнаються різними -факторами
-35
-10
E.coli 70
TTGACA
TATAAT
E.coli 32
TCTC-CCCTTGAA
CCCCAT-TA
E.coli 54
(-24)CTGG-A
(-12)TTGCA
B. sub A
TTGACA
TATAAT
B. sub B
AGGTTTAA
GGGTAT
B. sub D
CTAAA
CCGATAT
B. sub E
ATATT
ATACA
B. sub K
AC
CATA---T
B. sub H
CAGGA
GAATT—T
SPO1 gp28
AGGAGA
TTT-TTT
T4 gp55
-
TATAAATA
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

19. Елонгація транскрипції бактеріальною РНК-полимеразою

NusG
ЭЛОНГАЦИЯ
’
NusA
NusG
NusA
’
NusG
АРЕСТ:
гидролиз транскрипта
NusA
’
GreA/B
NusG
ТИМИНОВЫЙ ДИМЕР:
диссоциация, репарация
NusA
’
Mfd
TT
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

20. Альтернативні механізми термінації транскрипції прокаріот

зависимая
терминация
NTP
NDP
NusA
посадка
пауза
ТЕРМИНАЦИЯ
NusG
’
независимая
терминация
’
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

21. Регуляція транскрипції на стадії ініціації.

Нуклеотиды
Активаторы
’
Альтернативные
-факторы
Энхансеры
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University
Репрессоры

22. Регуляція транскрипції на стадії елонгації і термінації

Связывание репрессора
’
Аттенюация
1
2
3
’
1. Скорость
трансляции
2. Скорость
транскрипции
3. Связывание
белка
Антитерминация
N
NusG
NusA
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University
’

23.

Геном фагу лямбда
Геном
tL1
NuI A...J
att int xis
tR1
CIII N rex CI cro CII OP Q SR
PL
PR
Pi/CII
Ранние гены:
NuI A...J
tR2
tt
Po
PRE/CII
PR’
PaQ/CII
N выключает терминаторы
tL1 и tR1
tR2tt
tL1
tR1
att int xis
CIII
rex CI
OP Q SR
Po
Pi/CII
PRE/CII
PR’
PaQ/CII
Отсроченно ранние гены: Принятие решения
cAMP
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University
HflA
CII

24.

Геном
tL1
NuI A...J
att int xis
tR1
CIII N rex CI cro CII OP Q SR
PL
PR
Pi/CII
Ранние гены:
NuI A...J
tR2
tt
Po
PR’
PRE/CII PaQ/CII
N выключает терминаторы
tL1 и tR1
tR2tt
tL1
tR1
att int xis
CIII
rex CI
OP Q SR
Po
Pi/CII
PRE/CII PaQ/CII
Отсроченно ранние гены: Принятие решения
cAMP
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University
PR’
HflA
CII

25.

Лизогения: СII включает int, СI и антисенс Q
tL1
NuI A...J
att
xis
CIII N rex
PL
tR2
tR1
cro
PR
tt
OP Q SR
Po
PR’
Лизогения: СI выключает все, кроме PRM
tL1
NuI A...J
att int xis
CIII N rex
tR1
cro CII OP Q SR
Po
Pi/CII
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University
tR2
tt
PR’
PRE/CII PaQ/CII

26.

Активация профага:
СI разрезается recA, cro выключает PRM
tL1
NuI A...J
att int xis
CIII N rex CI
tR1
CII OP Q SR
Po
Pi/CII
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University
tR2
tt
PR’
PRE/CII PaQ/CII

27.

Лизис: синтез репликативных генов
tL1
NuI A...J
att int xis
tR1
rex CI
SR
Po
Pi/CII
tR2tt
PR’
PRE/CII PaQ/CII
Лизис: Q выключает терминатор tt
tL1
att int xis
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University
tR2 tt
CIII N rex CI cro CII OP
PL
Pi/CII
tR1
PR
Po
PR’
PRE/CII PaQ/CII

28. Механізми антитермінації фага .

Механізми антитермінації фага .
Антитерминация N
NusG
S10
N
NusA
’
nut
Антитерминация Q
’
Q
пауза
qut
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

29. Активація ранніх та середніх генів бактеріофагу T4.

РАННИЕ
гены
Alt
ADP
76kD
’
Лучше узнаются
ранние промоторы
СРЕДНИЕ
гены
Активатор
средних генов
AsiA
MotA
mot
box
Mod
Не узнается -35 box,
взаимодействие с MotA
TATA
24kD
’
ADP
?
Alc
19kD
Терминация на ДНК,
не содержащей 5-НОСН2Сyt
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University
ADP

30. Активація пізніх генів бактеріофагу T4.

ПОЗДНИЕ
гены
Адаптор
gp55
gp44/62
gp33
gp55
’
Alc
ADP
ADP
3x gp45
-фактор
поздних генов
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University
“Подвижная скрепка”
в репликации

31.

Геном М13
Gene:
Product
Size:
1
35-40kd
NS membrane protein; few copies/cell; interacts with host fip gene
product (thioredoxin); required for assembly
2
46kd
Site- & strand-specific endonuclease/topoisomerase; ~103
copies/cell; required for replication of RF
X (10)
12kd
(111aa)
N-terminal fragment of gene 2; ~500 molecules/cell; required for
replication of RF
3
42kd
5 copies at one end of particle; required for correct morphogenesis
of unit-length particles; N-terminal domain binds to F pilus of host
cell (receptor)
4
49kd
NS membrane protein; few copies/cell; required for assembly
5
10kd
(87aa)
Major structural protein during replication; ~105 copies/cell;
controls expression of g2p; binds to DNA; replaced by g8p during
assembly; controls switch from RF replication to progeny (+)stand
synthesis
6
12kd
(112aa)
~5 copies at same end of particle to g3p; involved in attachment &
morphogenesis
7/9
3.5kd
~5 copies at opposite end of particle to g3p/g6p; involved in
assembly
8
5kd
(50aa)
Major coat protein: ~2700-3000 copies/virion
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University
Function:

32.

Фаг Т7 – синтезується власна ДНКзРНКп (+
прдукт гену 2 – інгібітор клітинної ДНКзРНКп)
! – поліцистронні мРНК ранніх генів
розщепляться клітинно РНКазо ІІІ до
моноцистронних
Фаг N4 - власна ДНКзРНКп присутня в складі
віріону (Мм 320 kDa) – транскрипція ранніх
генів; + кодується друга ДНКзРНКп для
середніх генів (3 субодиниці)
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University

33. Самостійна робота

Скласти
схему транскрипції фагу М13
Valeriy Polischuk Virology Department Kyiv National Taras Shevchenko University