Виды полимераз

1.

Виды полимераз

2.

Полимераз
ы
Taq-ДНКполимераз
а
Hot Start
полимераза
Тип и Источ
Особенность
ДНКзависимая
ДНКполимераза
из
термофильно
й бактерии
Thermus
aquaticus
Термостабильность
Использование антител
или
олигонуклеотидных
последовательностей
(аптамеры) для
блокирования
активности полимеразы
при комнатной
температуре (20-22°C) во
время подготовки
реакционной смеси для
ПЦР.
Темп оптимум
Концевой участок
72 °С
добавляет лишний остаток
Максимальная
аденина на 3'-конце, в
активность фермента результате чего продукты
проявляется при темп. полимеразной цепной реакции
70-74°С (фермент
образуются с адениновыми
может работать и при выступами. Как следствие этой
более низких
особенности, полученные при
температурах от 25°С), амлификации Taqвремя полужизни при полимеразой фрагменты ДНК
94°С составляет
чрезвычайно удобны для
прибл. 45 мин.
клонирования в векторы с
тимидиновыми выступами.
Амплификация
Экзонуклеазная активность
Недостаток
Способна
амплифицировать 1 т.п. н.
ДНК за 30 с.
Фермент осуществляет
синтез ДНК в
направлении 5'->3' в
присутствии ионов Mg2+
обладает 5'->3'
экзонуклеазной
активностью (эта
активность проявляется
только при работе
фермента на
двухцепочечной ДНК).
отсутствие
проверочной
активности,
поскольку у нее нет
свойств 3'экзонуклеазы. За
один цикл
репликации в
молекуле ДНК
возникает около
2*10-4 ошибок на
основание
температура
денатурации
комплекса
"блокировки"
полимеразы часто
составляет 45-55°С,
что не всегда
мешает полимеразе
успеть наработать
неспецифические
продукты. Другим
недостатком, в случае
с использованием
антител, является
возможность
контаминации ДНК,
оставшейся после
очистки антител.

3.

Максимальная
проявлет транскриптазную
активность
активность (синтез ДНК в
фермента
РНКнаправлении 5'-> 3', используя в
Амплификаты,
обладает 5'->3'
проявляется при
Максимальная длина
зависимая
качестве матрицы РНК) в
Tthполученные с
экзонуклеазной
темп. 70-74°С
амплификата,
ДНКприсутствии ионов
(фермент может
полимер
использованием Tt
активностью (эта
которую можно
полимераз Mn2. используя Tth полимеразу
работать и при
аза: T.
h полимеразы,
активность проявляется
можно получать транскрипты в
получить с
а
более низких
thermoph
могут иметь на
только при работе
среднем до 800 п.н., что
использованием Tth
концах
фермента на
ilus HB-8
температурах от
полимеразы, прибл.
Thermus
позволяет использовать этот
(ОТ-ПЦР)
выступающую
двухцепочечной ДНК).
25°С), время
5'000 п.н.
thermophil
фермент в реакциях
полужизни при 94°С
букву A.
совмещенной обратной
us
составляет прибл.
транскрипции (ОТ) и ПЦР.
25 мин.
M-MulV
Обратная
транскрипт
аза
(ревертаза)
Максимальная
активность
проявляется при 42
°С, при этом она
сохраняется вплоть
до 50 °С
Вирус
лейкемии
мышей
ДНКзависима
я РНКполимер
аза Т7
Фаг Т7
Может встраивать в цепь РНК
модифицированные
нуклеотиды (аминоацил-, биотин, флуоресцеин-, дигоксигенинмеченые).
Используется для приготовления
меченых РНК зондов и для
Синтез фрагментов
кДНК длиной до 7
тысяч нуклеотидов;
Возможность
включать
модифицированные
основания в состав
кДНК;
катализирующая
синтез фрагментов
РНК в направлении
5'>3' на
одноцепочечной или
двуцепочечной ДНКматрице, находящейся
под контролем этого

4.

ДНКполимераза
Pfu
(высокоточ
ная)
LR (long
reading)
Plus
полимераза
Pyrococcus
furiosus
Обладает 3'→5' экзонуклеазной
активностью
Продукт ПЦР имеет тупой
конец и может быть
непосредственно
соединен с тупым
клонирующим вектором
Важная особенность LR полимеразы
Максимальная
Амплификаты,
Максимальная длина
заключается в том, что наличие 3'->5'
активность фермента
полученные с
амплификата, которую
экзонуклеазной активности делает этот проявляется при темп. использованием LR Plus
можно получить при
фермент более "медленным",
70-74°
полимеразы, не имеют на оптимальных условиях с
чем Taq полимераза. При этом
концах выступающую
использованием LR поли
снижается чувствительность к
букву A, т.е. являются
меразы прибл. до 40'000
низкокопийной матрице.
тупоконечными.
п.н.
LR полимераза в первую очередь
предназначена для получения
протяженных фрагментов и не годится
для высокочувствительного ПЦР
обладает 3'->5'
экзонуклеазной активностью
(так называемая
"проверочная активность" "proofreading activity"). При
работе в оптимальных
условиях LR Plus полимераза
допускает значительно
меньшее количество ошибок
по сравнения
с Taq полимеразой.

5.

6.

Репликационная вилка

7.

8.

Фёрстеровская (флуоресцентная) резонансная
передача энергии (Fӧrster (Fluorescence)
Resonance Energy Transfer – FRET)