Механизмы сохранения бактерий в неблагоприятных условиях

1. Механизмы сохранения бактерий в неблагоприятных условиях

• L-трансформация – постоянная или
временная утрата клеточной стенки делает
бактерии нечувствительными к антителам и
антибиотикам, действующим на клеточную
стенку. Утрата антигенов клеточной стенки
дает возможность длительно находиться в
организме.
• Спорообразование –закрепленная
генетически способность образовывать
споры – клетки с низкой метабол.
активностью и высокой резистентностью.
Основные фазы – споруляция (в неблагопр.
условиях) и прорастание (в благоприятных).

2. Некультивируемые формы

• характерны для неспоровых грамбактерий,
• не высеваются на питательных средах
(не образуют колоний),
• выявляют в ПЦР,
• соответствуют фазе резервации
возбудителя,
• сохраняют патогенные микробы во
внешней среде (холерный вибрион).

3. Схема образования споры. А и Б. Образование септы. В и Г. Окружение протопласта споры протопластом материнской клетки. Д.

Образование кортекса и оболочек споры. Е.
Схема строения зрелой споры. 1 - экзоспориум; 2 - наружная
оболочка споры; 3 - внутренняя оболочка споры; 4 - кортекс; 5
– клеточ. стенка зародыша; 6 – цитоплазм. мембрана; 7 цитоплазма с ядерным в-вом (Шлегель Г., 1987).

4. Поверхностные структуры бактерий: капсула, волосовидные придатки - жгутики, F-пили, фимбрии

• Капсула (слизистый слой, чаще состоит из
полисахаридов и выявляют по Бурри-Гинсу)
защищает от высыхания, фагоцитоза, у
сапрофитов – во внешней среде, у
патогенов – в организме хозяина.
• Фимбрии (реснички) – короткие нити,
аппарат адгезии к субстратам (слизистым).
• F-пили – фактор фертильности – аппарат
конъюгации.

5.

• Жгутики – аппарат движения (хемотаксис,
аэротаксис, фототаксис) –спирально
изогнутые нитевидные структуры. Состоят из
сократительного белка флагеллина.
• По количеству и расположению жгутиков
выделяют бактерии – монотрихи, лофотрихи
(пучок), амфитрихи (по полюсам), перитрихи
(по всему периметру).

6. Расположение жгутиков у бактерий

• А – монотрихи
• В – лофотрихи
• С – амфитрихи
• D - перитрихи

7. Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии ОмГМА Рудаков Николай Викторович д.м.н., профессор

Лекция № 3. Биохимия и ферменты бактерий
Хим. элементы: 1.Биогенные – C, O, N, H (95%)
2. Макроэлементы – P, S, Cl, K, Mg, Ca, Na (около 5%)
3.Микроэлементы – Fe, Cu, I, Co, Mo (доли %). Вода -70-90%
Белки: флагеллин, пилин, порины, белок А, белок М,
пептидогликан
Липиды: фосфолипиды, жирные кислоты – миколовая,
туберкулостеариновая
Тейхоевые кислоты –линейные полимеры, содержащие остатки
рибола или глицерина, связанные фосфодиэфирными связями=
поверхностные антигены клеточной стенки грам+ бактерий.
Углеводы: полисахариды, декстраны, липополисахариды (ЛПС).
Нуклеиновые кислоты: ДНК, РНК. Азотистые основания: А
(аденин), Г (гуанин), Ц (цитозин), Т (тимин). Г+Ц%

8.

9. Пептидогликан – биополимер, составляет основу клеточной стенки, ригидная мешковидная макромолекула, определяет постоянство

формы и др. биол. свойства
бактерий
• Состоит из остова (чередующиеся молекулы двух
аминосахаров) и двух наборов пептидных цепочек
– боковых и поперечных, имеет структуру
молекулярной сети.
• Обладает антигенными свойствами.
• Активирует систему комплемента.
• Тормозит фагоцитарную активность и миграцию
макрофагов.
• Способен вызывать гиперчувствительность
замедленного типа.
• Оказывает пирогенное действие (лихорадка).

10.

11. Липополисахариды (ЛПС) – одни из основных компонентов клеточной стенки грам- бактерий

• Состоит из трех компонентов – липида А
(токсин), полисахаридного ядра,
терминальной О-специфической боковой
цепи. Синонимы ЛПС – эндотоксин, О –
антиген.
• Определяет антигенную специфичность
грам – бактерий и является одним из
факторов их патогенности.
• Освобождается при разрушении грам –
бактерий, запускает синтез более 20
биологически активных веществ,
определяющих патогенез эндотоксикоза,
обладает пирогенным действием.

12.

13.

Классы ферментов: 1.оксидоредуктазы
2.трансферазы 3.гидролазы
4.лиазы 5.лигазы или синтетазы 6. изомеразы
Ферменты патогенности: нейраминидаза,
гиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа,
ДНК-аза, протеаза, фибринолизин
В генной инженерии и генодиагностике:
рестриктазы (эндонуклеазы), ДНК-синтетазы,
ДНК-полимераза, обратная транскриптаза
Для идентификации – сахаролитические,
протеолитические, ферменты патогенности,
оксидоредуктазы

14.

Биохимическая активность бактерий
● Различия в ферментном составе
используют для идентификации
бактерий по их б/х свойствам:
- сахаролитические (расщепление
сахаров),
- протеолитические (разложение белков).
● Сахаролитические свойства определяют
на дифференциально-диагностических
питательных средах Гисса, Эндо,
Левина, Плоскирева по конечным
продуктам расщепления: кислота, газ.
● Протеолитические свойства
определяют:
- по разжижению желатина;
- продуктам разложения белка в
мясопептонном бульоне - индолу,
сероводороду, аммиаку.

15. Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии ОмГМА Рудаков Николай Викторович д.м.н., профессор

Лекция № 4. Физиология и принципы культивирования
бактерий
Метаболизм (обмен в-в и энергии): анаболизм и катаболизм.
По поступлению в-в: осмотрофы (прокариоты) и фаготрофы.
По источнику энергии: фототрофы и хемотрофы.
По потребности в в-вах: прототрофы и ауксотрофы (факторы
роста).
По потреблению С: аутотрофы (СО2) и гетеротрофы
(органический С) - сапрофиты, паразиты.
Регулятор поступления в-в в бактериальную клетку –
цитоплазматическая мембрана.
4 механизма: пассивная диффузия, облегченная диффузия,
активный транспорт, транслокация (перенос групп).
Пермеазы, фосфотрансферазная система.

16.

17.

Дыхание бактерий – способ добывания энергии,
биологический процесс переноса электронов через
дыхательную цепь от доноров к реципиентам с
образованием АТФ- универсального аккумулятора
химической энергии.
● Аэробным называется дыхание, где акцептором
электронов является молекулярный кислород (О2).
● Анаэробное дыхание - акцептором служит
связанный кислород (нитрат, сульфат и др.) нитратное, сульфатное.
● Ферментативное расщепление углеводов
происходит в основном в анаэробных условиях
(брожение). По конечному продукту расщепления
углеводов различают спиртовое, молочнокислое,
уксуснокислое и другие виды брожения.

18.

По отношению к молекул. кислороду бактерии
разделяют на 4 группы: ● Облигатные
(обязательные) аэробы могут расти только при
наличии кислорода и образуют перекисные
радикалы кислорода, которые инактивируются
соответствующими ферментами: каталазой,
пероксидазой и супероксиддисмутазой.
● Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенном
парциальном давлении свободного кислорода
(газовые смеси с 10% СО2).
● Облигатные анаэробы растут без свободного
кислорода. Перекисные радикалы кислорода
токсичны для анаэробов, которые не образуют
инактивирующие ферменты.

19.

Факультативные анаэробы растут как при
наличии, так и отсутствии кислорода. В
присутствии молекулярного кислорода они
способны переключаться на аэробное
дыхание. В отсутствие кислорода способны к
анаэробному дыханию, называемому
нитратным: нитрат, являющийся
акцептором водорода, восстанавливается до
молекулярного азота и аммиака.
● Среди анаэробов - аэротолерантные, которые
растут при наличии молекулярного
кислорода, но не используют его.

20.

Культивирование анаэробов
Применяют специальные питательные среды
(Кита-Тароцци, тиогликолевая среда - связывающие
кислород). Перед посевом среды кипятят для
удаления растворенного кислорода.
● Применяют физические, химические и
биологические методы культивирования анаэробов.
● Физический метод - удаляют из аппарата
воздух. Для выращивания используют
анаэростаты - специальные емкости, в
которых воздух заменяется смесью газов,
не содержащих кислорода.
Химический метод основан на
применении химических поглотителей
кислорода.

21.

• Биологический метод - одновременный
посев на одну половину чашки Петри
аэробных и на другую - анаэробных
бактерий. Аэробы, используя при росте
кислород, создают условия для
дальнейшего роста анаэробов.
• Анаэростаты, система «Газпак».

22.

Рост и размножение бактерий
● Рост - формирование компонентов бактериальной
клетки с увеличением ее размеров.
● Размножение - самовоспроизведение, приводящее к
увеличению количества бактериальных клеток в
популяции.
● Бактерии размножаются бинарным делением пополам,
реже почкованием.
● Грам+ бактерии делятся путем врастания
синтезирующихся перегородок внутрь клетки, Грам▬
бактерии - путем перетяжки и образования двух
одинаковых клеток.
● Делению клеток предшествует репликация
бактериальной хромосомы по полуконсервативному
типу: двунитевая цепь ДНК раскрывается и каждая
нить достраивается комплементарной нитью.
Репликация ДНК катализируется ДНК-полимеразами.

23.

Размножение бактерий в жидкой
питательной среде
Периодическая система культивирования
– если бактерии засеваются в
постоянный объем жидкой питательной
среды. При размножении они
потребляют питательные вещества, что
приводит к истощению среды и
прекращению роста бактерий.
При выращивании бактерий на жидкой
питательной среде наблюдается:
придонный рост культуры, диффузный,
поверхностный (в виде пленки).

24.

Фазы развития
периодических культур
1) лаг-фаза;
2) фаза логарифмического
роста;
3) фаза стационарного роста
или максимальной
концентрации бактерий;
4) фаза гибели бактерий.
● Лаг-фаза (от англ. Lag- запаздывание) - период от посева
бактерий до активного размножения ( адаптация к среде).
Бактерии готовятся к делению, повышается количество
нуклеиновых кислот, белка и других компонентов клетки.
● Фаза логарифмического (экспоненциального) роста - период
интенсивного размножения.
● Фаза стационарного роста – соответствие количества новых и
отмирающих клеток (максимальное количество клеток
сохраняется).
● Рост бактерий завершается фазой гибели - отмирание клеток
в условиях истощения питательной среды и накопления в
ней продуктов метаболизма.

25.

• Непрерывное культивирование - если условия
культивирования поддерживать путем
непрерывной подачи свежей питательной среды и
оттока такого же объема культуральной жидкости
(хемостаты).
• В промышленных условиях при получении
биомассы микроорганизмов с целью
приготовления антибиотиков, вакцин,
диагностических препаратов и эубиотиков
культивирование осуществляют в ферментерах
при соблюдении оптимальных параметров для
роста и размножения культур.

26.

Размножение бактерий
на плотной питательной среде
Бактерии на плотных питательных
средах чаще образуют
изолированные колонии округлой
формы с ровными или неровными
краями различной консистенции и
цвета (пигмента).
● Пигменты, растворимые в воде,
диффундируют в питательную
среду и окрашивают ее.
● Наиболее распространены
пигменты: каротины, ксантофиллы,
меланины.
Пигменты защищают микробы от
воздействия токсичных
перекисных радикалов кислорода.
● Многие пигменты обладают
антимикробным, антибиотикоподобным действием
(конкуренция).

27.

● Культуральные
свойства бактерий:
вид, форма, цвет
(пигмент) и другие
особенности
колоний на плотной
питательной среде
учитывают при
идентификации
бактерий, а также
отборе колоний для
получения чистых
культур.

28.

Культивирование бактерий
Бактерии выращивают на естественных и
искусственных питательных средах.
● Естественные питательные среды (молоко,
сусло-агар, сиропы) имеют
несбалансированное соотношение
компонентов.
● Искусственные питательные среды
включают вещества в строго определенных
соотношениях с учетом потребностей данного
вида в питательных веществах, ростовых
добавках, солях и т.п.

29. Требования к питательным средам:

• должны быть стерильными,
• иметь необходимые для роста бактерий
компоненты,
• оптимальные значения рН и
окислительно-восстановительного
потенциала, осмотического давления.
● Среды различаются в зависимости от
консистенции, состава и назначения. По
консистенции - плотные, полужидкие и
жидкие; по составу – простые и
сложные; по назначению - специальные,
элективные и дифференциальнодиагностические.

30.

● Основой плотной питательной среды являются
гелеобразующие вещества - отвердители - агар-агар
(2 - 3 %) или желатин (10-15 %), которые добавляют
в жидкие питательные среды (мясопептонный
бульон – МПБ мясопептонный агар - МПА).
● Простые питательные среды применяют для
выращивания непритязательных к питательным
средам бактерий.
● Сложные питательные среды включают
дополнительные компоненты - сыворотку крови
(сывороточный агар), кровь (кровяной агар), сахар
(сахарный бульон). Их используют для
выявления свойств бактерий, т.е. это специальные
питательные среды (например, на кровяном агаре
бактерии, продуцирующие гемолизин, образуют
колонии с зоной гемолиза).

31.

● Элективные (избирательные) среды используют для выделения определенных
видов бактерий.
Желточно-солевой агар (ЖСА) элективная среда для стафилококков.
Щелочный МПА - для холерного
вибриона; свернутая сыворотка - для
коринебактерий дифтерии.

32.

● Дифференциально-диагностические среды (Гисса,
Эндо, Левина, Плоскирева) для дифференцирования
бактерий по культуральным признакам.
● Среды Гисса (пестрый ряд) состоят из МПБ или
полужидкого МПА с добавлением углевода (лактозы,
сахароза, глюкозы, маннита и др.) и индикатора,
меняющего цвет при расщеплении углевода с
кислотообразованием.
● Среды Эндо и Левина - мясопептонный агар с лактозой
и индикатором рН.
- Бактерии, расщепляющие лактозу с
кислотообразованием (лактозо+), образуют колонии на
среде Эндо - красного цвета с металлическим блеском,
на среде Левина - темно-синего (цвет зависит от
индикатора).
- Не расщепляющие лактозу (сальмонеллы, шигеллы)
образуют неокрашенные (лактозонегативные) колонии.

33.

Среды Эндо и Левина мясопептонный агар с лактозой и
индикатором рН.
- Бактерии, расщепляющие лактозу с
кислотообразованием (лактозо+),
образуют колонии на среде Эндо красного цвета с металлическим
блеском, на среде Левина - темносинего (цвет зависит от индикатора).
- Не расщепляющие лактозу
(сальмонеллы, шигеллы) образуют
неокрашенные (лактозонегативные)
колонии.

34.

Бактериологический
метод
применяют с целью
обнаружения
(индикация) в
объектах окружающей
среды и клиническом
материале бактерий и
определения их
видовой
принадлежности
(идентификация).
Метод заключается в
посеве проб
исследуемого
материала на
питательные среды
для получения
(выделения) чистой
культуры.

35.

Выделение чистых культур
производят поэтапно:
1-й день - используют
механическое разобщение
бактерий на плотных питательных
средах (посев штрихом, шпателем
на несколько чашек Петри – по
Дригальскому).
При выделении чистых культур
анаэробов посевы исследуемого
материала производят в
анаэробных условиях на
специальных средах с
пониженным редокс-потенциалом
в анаэростатах.

36.

● 2-й день. Получают отдельные
изолированные колонии.
Изучают культуральные св-ва
различных типов колоний
(размер, цвет, форма, края и др.),
выросших на чашке с плотной
питательной средой. Делают
пересев из каждого типа колоний
на скошенный агар для
накопления чистой культуры.
● 3-й день: чистую культуру (после
проверки ее чистоты
микроскопией) идентифицируют
по свойствам: морфологическим,
тинкториальным, биохимическим,
антигенным, определяют
токсигенность, фаговар и др.

37. По температурному оптимуму культивирования:

1.Мезофилы – диапазон от +20 до +45 градусов Цельсия.
2.Термофилы – растут при температурах выше +45 градусов
Цельсия.
3.Психрофилы – растут при температурах ниже +20 градусов
Цельсия.
Для культивирования применяют термостаты.
Основные принципы получения чистых культур: механич.
разобщение, рассев, серийные разведения,
использование элективных сред и особых условий
культивирования. Метод Шукевича (ползучий рост
подвижных бактерий). Метод Коха (пластинчатые
разводки). Метод Дригальского (посев в три чашки
последовательно одним шпателем). Метод Вейнберга
для анаэробов (заливают агаровую среду смесью
парафина и вазелинового масла).