Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Практическое занятие №6

1.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 6
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ.
-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ
-ДЫХАНИЕ БАКТЕРИЙ
-МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБОВ

2.

Бактериологический метод диагностики – это
выделение и идентификация чистой культуры.
«Чистая культура» - это бактерии одного вида,
выделенные на питательной среде.
«Колония» - это потомство одной бактериальной
клетки, выросшей на питательной среде.

3.

Этапы Бактериологического метода:
I этап (нативный материал)
1. Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре).
2. Посев на плотные питательные среды (получение колоний).
II этап (изолированные колонии)
1. Изучение колоний (культуральные свойства бактерий).
2. Микроскопическое изучение микробов в окрашенном мазке
(морфологические свойства бактерий).
3. Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой культуры.
III этап (чистая культура)
Определение культуральных, морфологических, биохимических
и других свойств для идентификации культуры бактерий

4.

Идентификация чистой культуры- это
изучение свойств чистой культуры
бактерий с целью установления
принадлежности к той или иной
систематической группе
(роду, виду, варианту)

5.

III Этап Бак.метода
Идентификация чистой культуры
2.Морфологические и
1. Культуральные
свойства - характер
роста колоний на
скошенном агаре.
Тинкториальные свойства
(проверка чистоты
культуры )
3.Биохимические
свойства чистой
культуры.
III ЭТАП Бактериологического метода
4.Чувствительность к
бактериофагу
5.Патогенность для
лабораторных
животных.
6.АГ свойства
(серодиагностика)

6.

Биохимические свойства бактерий
Зависят от набора ферментов (у каждого вида бактерий он свой).
I.Классификация ферментов - Биохимическая: оксидоредуктазы, трансферазы, лиазы , гидролазы,
изомеразы, лигазы.
II. В зависимости от локализации:
а) эндоферменты – локализуются в клетке в цитоплазме или в периплазматическом пространстве, либо
связаны со структурами клетки (т.е действуют внутри клетки);
б) экзоферменты – выделяются в окружающую среду. (Для расщепления макросоединений до простых
продуктов).
К этой группе относят ферменты патогенности бактерий - это ферменты, которые
способствуют проникновению бактерий в ткани макроорганизма, распространению по нему
и оказывают поражающее действие на его клетки и ткани.
( Пример: гиалуронидаза, лецитинидаза)
III. В зависимости от субстрата: сахаролитические, протеолитические, липолитические.
IV.В зависимости от постоянства синтеза:
а) конститутивные – синтезируются и присутствуют в клетке всегда в постоянной концентрации.
б) индуцибельные – их концентрация резко изменяется в зависимости от наличия
или отсутствия субстрата во внешней среде.
(т.е.чтобы клетка начала синтез, необходим индуктор, в качестве которого выступает S. Если нет
S, то этот E не вырабатывается, пример пеницилиназа).

7.

Группы сред определяющих БХ
свойства:
-Дифференциально диагностические
-Дифференциально- диагностические +
селективные

8.

Дифференциально-диагностические среды
позволяют отличить один вид микроорганизмов от
другого на основании разной биохимической
активности бактерий.
В состав дифференциально-диагностических сред
входят:
- основная питательная среда, обеспечивающая
размножение бактерий,
- определенный химический субстрат, различное
отношение к которому является диагностическим
признаком,
- индикатор, изменение цвета которого
свидетельствует о расщеплении субстрата и
образовании конечных продуктов.

9.

Среда Эндо
Состав:
• питательный агар,
• лактоза,
• основной фуксин.
Среда имеет розовый оттенок.
Колонии бактерий, ферментирующих лактозу лак+
(лактозопозитивные), окрашиваются в темно-красный цвет с
металлическим блеском;
колонии бактерий, не ферментирующих лактозу лак(лактозонегативные), остаются бесцветными
(цвета самой среды).

10.

Среда Левина
Состав:
-питательный агар,
-лактоза,
-эозин и метиленовый синий.
Среда имеет коричневатый оттенок.
Колонии бактерий, ферментирующих лактозу Лак+
(лактозопозитивные), окрашиваются в темно-синий цвет;
Колонии бактерий, не ферментирующих лактозу лак(лактозонегативные), остаются бесцветными (цвета самой
среды).

11.

Среда Плоскирева
Особенность: Диф.-диагностическая + селективная среда
(E.coli и Salmonella )
Состав:
-питательный агар,
-лактоза,
-нейтральный красный,
-соли желчных кислот,
-бриллиантовый зелёный.
Среда имеет розовато-желтоватый оттенок.
Колонии бактерий, ферментирующих лактозу лак+
(лактозопозитивные), окрашиваются в бруснично-красный цвет.
Колонии бактерий, не ферментирующих лактозу лак
(лактозонегативные), остаются бесцветными.

12.

Среды Гисса (пестрого ряда)
сахаролитические свойства
• Представляют собой набор питательных сред с углеводами
моносахариды: глюкоза, лактоза;
дисахариды: мальтоза, сахароза;
многоатомные спирты — маннит.
• Состав: пептонная вода+углевод+индикатор
• По консистенции различают:
-жидкие (менее 0,3% агар-агара)
-полужидкие (0,3-0,7% агар-агара)

13.

Cостав:
Жидкие среды Гисса:
1.Пептонная вода
2.Углевод
3.Индикатор - Андреде
(кислый фуксин + NaOH): в
нейтральной среде бесцветный или розовый, в
кислой среде – малиновокрасный
4.Поплавок (фрагмент
запаянной стеклянной трубки)
используют для определения
процесса газообразования.
Результат:
1. Ферментация S до кислых подуктов.
2. До кислых продуктов + газа
3. Отсутствие ферментации S

14.

Cостав:
Полужидкие среды Гисса:
1. Пептонная вода + 0,5% агар
2. Углевод
3. Индикатор - ВР (водный
голубой с розоловой
кислотой):
в нейтральной среде оранжевато - розовый или
розовый,
в кислой среде – синефиолетовый
Результаты:
1. Нет ферментации среды
2. Ферментация среды без образования газа
(синефиолетовый цвет, монолит сохранен)
3.Ферментация среды (кислая ср.) с образованием
газа (пузырьки газа разрыхляют монолит).

15.

16.

Протеолитические свойства
1.Тест на расщепление
желатина
(жив.белков, фермент
желатиназа)
Посев производят методом
«укола» в столбик 10 - 20%
желатина .
Результат:
При наличии протеолитических
ферментов происходит разжижение
желатина, этот процесс идет сверху вниз.

17.

2.Тест выявления пептолитических свойств
При глубоком расщеплении белков образуются аммиак,
сероводород, индол.
В жидкую среду -стерильный МПБ, делают посев Чистой
культуры под крышку вставляют индикаторные бумажки они
белого цвета, и пропитаны индикатором.
Аммиак определят с помощью посинения лакмусовой
бумажки
Н2S - фильтровальной бумажки, пропитанной раствором
уксуснокислого свинца. Н2S взаимодействует с уксуснокислым
свинцом, образуя сульфид свинца, в результате чего бумага
чернеет.
Индол выявляют с помощью индикаторной бумажки,
смоченной раствором щавеливо-кислого Na, в случае
образования индола бумажка розовеет.

18.

Анаэробы
АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ – это микроорганизмы,
которые утрачивают способность к росту в присутствие
воздуха или молекулярного кислорода.
Они делятся между собой по чувствительности к кислороду:
I Облигатные (растут лишь в анаэробных условиях)
- строгие (0,5 - 4% кислорода)
- умереннные (до7 - 8% кислорода)
II Факультативные (могут расти и размножаться в
присутствии так и в отсутствии О2)

19.

Среды для культивирования умеренных
анаэробов
Среда Китта-Тороцци это жидкая среда
Cостав:
МПБ + глюкозы + кусочки печени или фарша (для связывания О2)
сахарный бульон
Прежде чем сеять среду кипятят для удаления воздуха. После
посева среду заливают вазелиновым маслом.Инкубация.
Результат + : помутнение среды и как правило активное
газообразование за счет сбраживания глюкозы.

20.

Cреда Вильсона – Блера
(железосульфитный агар)- это твердая среда
Состав: МПА+глюкоза+сульфит Na + хлорид железа
Сахарный агар
Посев «уколом»
Результат: анаэробы вызыают
почернение питательной
среды за счет образования
соединений Fе с серой и разрыв
сахарного агара за счет
выделения газа т. е.
Почернение+ газообразование

21.

3. Высокий столбик сахарного агара
Результат: Газообразование (разрыхление
сахарного агара)
4. Посев в молоко
Под действием ферментов происходит
створаживание и образование сгустка«пробки» в области пробки собираются
газы.Иногда пробку газами поднимает к
крышке, такое явление назвали «Штормовая
реакция»
Результат: cгусток + газ

22.

Среды для культивирования строгих
анаэробов
Это среды с низким окислительно-восстановительным
потенциалом, т.е. способны связывать и редуцировать О2
Плотная или жидкая среда КАБ (кровянной агар для
бактероидов - разновидности анаэробов)
Основные компонеты: МПА или МПБ, гемин или цельная
кровь, витаман К, цистеин, декстрозы)
Тиогликолевые среды (тиогликолят Na-редуцирует О2)
Инкубацию проводят в бескислородных условиях

23.

Методы культивирования
анаэробов
Механический
принцип
1.Анаэростат
2.Система Gas-Pak
3.Перчаточный бокс
4.метод Фортнера(редко)
Химический
принцип
Биологический
принцип

24.

Анаэростат металлический
цилиндрический сосуд,
закрывающийся
герметически, из
которого удалён кислород
(выкачиванием воздуха) и
закачены
N2 - 85%, СО2 - 10%, Н2 5%

25.

Система GasPak™
состоит из двух основных
компонентов – герметично
закрывающегося, пластикового
контейнера с прозрачными
стенками, и газогенерирующим
пакетом однократного
применения за счет которых
происходит связывание О2.
Пакет вскрывают + Н2О. В пакете
таблтки с содержанием
различных веществ.
Боргидрид Na+ Н2О растворяется с
Н2 далее палладиевый
катализатор выделяет Н2 ,который
связывается с О2
Н2О

26.

Перчаточный бокс

27.

Метод Фортнера
На 1 половину чашки петри сеют аэробные бактерии, на
другую анаэробные.Герметично закрывают и заливают
горячим парафином и инкубируют.
В начале наблюдается активный
рост аэробных культур, затем они
исчерпывают запасы О2
и начинается рост анаэробных
микроорганизмов.