Сравнительный анализ состава микобиомов озимых зерновых культур после пика паразитической активности

1.

Сравнительный анализ состава микобиомов озимых
зерновых культур после пика паразитической активности
возбудителей снежной плесени.
И.Т.Сахабутдинов, А.Р.Мещеров, Е.А.Рязанов, О.А.Гоголева, И.Б.Частухина,
А.С.Балкин, Н.Е.Гоголева, Ю.В.Гоголев, В.Ю.Горшков

2.

Микробиом растений
Мутуалисты
(«полезные»)
Фитопатогены
(возбудители
заболеваний)
Состав и структуру
микробиома невозможно
корректно оценить с
помощью
микробиологических
методов

3.

Анализ микробиомa
Высокопроизводительное секвенирование
Метабаркодирование

4.

Метабаркодирование
Амплифицированные последовательности ампликоны
Microdochium
Cladosporium
ПЦР
Typhula
Tetracladium
Грибы (ITS2)
Бактерии (16S)

5.

Метабаркодирование
Вариабельные,
родо(видо)специфичные
участки
Microdochium
Cladosporium
Консервативные
участки
Консервативные
участки
Typhula
Tetracladium
Пул разных ампликонов, соответствующих разным таксонам; причем
количественное соотношение разных ампликонов в образце будет
соответствовать соотношению ДНК этих таксонов в исследуемом
материале

6.

Индексирование и секвенирование ампликонов
P5
P7
праймер
праймер
P5
Служебные
последовательности
индекс
P7
ITS2/16S
Служебные
последовательности

7.

Алгоритм биоинформатической работы
Cutadapt
Trimmomatic
FastQC
QIIME 2
DADA2
ITSx
Microbiome analyst
DECIPHER
MEGAX 11

8.

Применение метабаркодирования
Микробиом кишечника
Инфекционные заболевания растений
Микробиом почв
Лишь в единичных работах проанализированы
микробиомы пораженных заболеваниями
растений

9.

Снежная плесень озимых культур
Microdochium nivale
Психротолерантные
фитопатогенные
грибы-возбудители
снежной плесени

10.

Исследование патокомплекса снежной плесени
• В каком количестве возбудители
заболевания присутствуют в
растениях?
Генетическая и
фенотипическая
гетерогенность
штаммов
Microdochium
nivale
Информация о физиологии и генетике
возбудителей заболевания
• Какие микробные таксоны, наряду с
непосредственно возбудителем
заболевания, входят в состав
патосообщества?
На основе результатов метабаркодирования
мы реконструировали микробное сообщество
озимых
ржи,
пшеницы
и
тритикале,
пораженных снежной плесенью, чтобы
оценить вариабельность патосообществ трех
культур, а также отдельных культур,
произрастающих в разных агроценозах

11.

Отбор образцов для анализа
Агроценоз 1
Агроценоз 2
С. Кабаны, Лаишевский р-н
С. Наласа, Арский р-н
Рожь
Отмершие
побеги
Пшеница
Отмершие
побеги
Корни
Тритикале
Отмершие
побеги
Корни
Корни
Рожь
Отмершие
побеги
Корни
Пшеница
Отмершие
побеги
Корни
Тритикале
Отмершие
побеги
Корни

12.

Пробоподготовка
Выделение
ДНК
Синтез библиотек
ампликонов
(ITS2/16S)
Парноконцевое
секвенирование
ампликонов
A
A
T
G
C
T
T
T
A
C
G
A

13.

Сборка последовательностей ампликонов
(Amplicon Sequence Variant, ASV)
Селекция ридов
по качеству
Удаление технических
последовательностей
«Сшивание» прямого и
обратного рида
ASV_1
ASV_2
ASV_3
• 1352 ASV, соответствующих грибам
• 7627 ASV, соответствующих бактериям

14.

Присвоение таксономии ASV
База данных UNITE
Ампликоны (ASV)
……
ASV_1
Microdochium nivale
ASV_2
……
ASV_1352
Neoascochyta exitialis
• Грибы – 74 родов
• Бактерии – 497 родов
Cladosporium vulgaris

15.

Микробиомные профили
Количество ридов каждого
ASV в образцах
№1
ASV_1
№2
№3
14871 13000 14175
ASV_2
234 1156
ASV_3
1133 2341 1672
ASV_4
45
18
……
ASV_5
ASV_1352
6
2
25
0
1,00
…..
0,75
183
0,50
78
3
0,25
0,00
0
№1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 №9 №10 №11

16.

Бета-разнообразие микробных сообществ корней
0,4
0,2
Рожь
Ось 2 [12,6%]
Рожь
Агроценоз 1
Тритикале
0,0
Тритикале
Пшеница
-0,2
Пшеница
-0,25
0,00
Ось 1 [29,3%]
Агроценоз 2
0,25

17.

Дендрограмма состава микробных сообществ корней
4
Высота
3
2
1
0
Агроценоз 1
Агроценоз 2

18.

Таксоны, представленность которых вносит наиболее
значительный вклад в различие двух типов сообществ
1 2
Setaria viridis
Microdochium nivale
Flavobacterium aquidurense
1 – Образцы корней
тритикале
Cistella sp
Tetracladium sp.
Cistella sp
2 – Образцы корней
ржи
Oculimacula yallundae
Nonomuraea sp.
Tetracladium sp.
Leptosphaeria sclerotioides
Massilia frigida
Pseudogymnoascus pannorum
Microdochium bolleyi
Arthrobacter bambusae
Leptosphaeria sclerotioides
-2
-1
0
LDA score
1
2

19.

Микробные сообщества отмерших листьев
Дендрограмма
Бета-разнообразие
0,6
0,3
0,0
-0,3
-0,6
-0,5
0,0
0,5
Рожь
Тритикале
Пшеница
Агроценоз 1
Рожь
Тритикале
Пшеница
Агроценоз 2

20.

• Патосообщества, ассоциированные с развитием снежной плесени,
имеют особенности у разных озимых культур и особенно существенно
различаются в зависимости от почвенно-климатических условий.
• Вклад в вариабельность таких сообществ вносит микробиом корней, а в
отмерших частях побегов микробные сообщества существенно не
различаются у разных культур в разных агроклиматических условиях.
• Определены конкретные таксоны грибов и бактерий, вносящие
наибольший вклад в неоднородность патосообществ у разных озимых
культур и у отдельной культуры в разных условиях возделывания.

21.

Разные генетические варианты Microdochium nivale
Разные варианты (А, В)
последовательностей у
разных штаммов M. nivale
Тубулин
Фактор элонгации
ITS2
A
B
A
B
A
B
Агроценоз 2
Агроценоз 1
ITS2
Агроценоз 1
Содержание
Microdochium nivale, %
Агроценоз 2
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Корни
Отмершие листья
*
*
*
*
*
Пшеница
*
Рожь
Тритикале
Пшеница
Рожь
Тритикале

22.

Содержание
M. nivale, %
Фактор элонгации трансляции
Отмершие листья
Корни
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
Пшеница
Рожь
Тритикале
Пшеница
Рожь
Тритикале
Содержание
M. nivale, %
Бета-тубулин
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Отмершие листья
Корни
*
*
Пшеница
Рожь
Тритикале
Пшеница
Рожь
Тритикале

23.

Поиск антагонистов Microdochium nivale
Корреляционные сети:
I. Для каждой культуры в отдельности
II. Для разных культур вместе
III. Для попарного комбинирования
культур
IV. 2-3 варианты дифференциально
для разных агроценозов и для двух
агроценозов вместе
V. Все перечисленные варианты
дифференциально для корней и
отмерших листьев
Всего 26 корреляционных сетей

24.

Рода грибов/бактерий, содержание которых негативно
коррелирует с содержанием Microdochium nivale
Род
Коэф. корреляции
Рода грибов
Рода бактерий
Tetracladium
-0.7321
Leptosphaeria
-0,6681
Pseudogymnoascus
-0,6271
Cistella
-0.6037
Athelia
-0.6819
Oligoflexus
-0,5824
Aureimonas
-0,5145
Knoellia
-0,5019
Herbaspirillum
-0,7963
Flavisolibacter
-0,6053
Actinoplanes
-0,7956
Acidovorax
-0,6801

25.

Дополнение
Динамика патосообщества в ходе развития и зимовки растений
модели
осень
зима
весна
Разный уровень поражения заболеванием
Микробиомное профилирование
• критерии развития исследуемых патосообществ
• прогнозирование уровня развития исследуемого заболевания
• разработка эффективных средств биологической защиты
растений от снежной плесени.

26.

Дополнение модели
+1 критерий дифференциации
образцов
Сильно пораженные растения
Мало пораженные
Содержанием каких таксонов
грибов или бактерий различаются
микросообщества сильно- и
слабопораженного розовой
снежной плесенью растения?

27.

Благодарим за внимание!