Концепции и методы генной инженерии

1.

Концепции и методы
генной инженерии
Оразаева Ирина Владимировна
кандидат сельскохозяйственных наук, доцент агрономического факультета
Белгородского ГАУ

2.

План:
1. Возникновение и развитие генетической инженерии
2. Ферменты генной инженерии
3. Разделение фрагментов ДНК по размерам
4. Понятие о плазмидах и векторах

3.

1. Возникновение и развитие
генетической инженерии

4.

Возникновение и развитие генетической инженерии
Молекулярная
генетика
–
наука,
занимающаяся
исследованием
строения
геномов, функционированием генетических
систем на молекулярном уровне.

5.

Возникновение и развитие генетической инженерии
Генная
инженерия
—
раздел
экспериментальной
молекулярной
биологии,
совокупность приемов, методов и технологий, в
том числе технологий получения рекомбинантных
рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых
кислот, по выделению генов из организма,
осуществлению манипуляций с ними и введению
их в другие организмы.

6.

Возникновение и развитие генетической инженерии
Представления о закономерностях передачи наследственных
признаков от родителей к потомкам развивались постепенно и
одновременно
накапливались
сведения
о
структурах,
являющихся материальными носителями наследственности.
Д. Уотсон Ф. Крик
Р. Франклин
М. Уилкинс
Э.Чаргафф
Ф. Сталь
М. Месельсон

7.

Возникновение и развитие генетической инженерии
В 1973 году Стенли Коэну и Герберту Бойеру удалось объединить в
одну молекулу фрагменты ДНК из разных организмов.

8.

Возникновение и развитие генетической инженерии
Работы, определившие появление генетической инженерии
Доказательство в 1944 году О. Эйвери с соавторами, что носителем
генетической информации являются молекулы ДНК
Открытие структуры ДНК в 1953 году Дж. Уотсоном и Ф. Криком
Экспериментальное подтверждение универсальности генетического кода
Интенсивное развитие молекулярной генетики на объектах E. coli, ее
вирусов и плазмид
Отработка простых методов выделения высокоочищенных препаратов
неповрежденных молекул ДНК плазмид и вирусов
Разработка методов введения чужеродной ДНК в клетки
Открытие ферментов, использующих ДНК в качестве субстрата
катализируемых ими реакций

9.

Возникновение и развитие генетической инженерии
Современная стратегия генной инженерии
В векторную молекулу ДНК
ферментативно встраивают
фрагменты молекул ДНК
Гибридные или рекомбинантные
ДНК, вводят в компетентные
клетки, где они реплицируются,
размножая в своем составе
встроенные фрагменты ДНК
Отбирают клоны клеток,
содержащих индивидуальные
типы молекул гибридных ДНК

10.

Возникновение и развитие генетической инженерии
Качественно новый уровень генетических исследований
Возможность переноса гена в новое для
него генетическое окружение
Конструирование новых генов путем
объединения in vitro последовательностей
нуклеотидов
Применение изолированных генов в
составе генно-инженерных конструкций

11.

2. Ферменты генной инженерии

12.

Ферменты генной инженерии
В
генетической
инженерии
в
роли
«скальпеля», «ножниц» и «ниток для
сшивания» нуклеиновых кислот выступают
ферменты.

13.

Ферменты генной инженерии
Ферменты генной инженерии
Рестриктазы
Полимеразы
Синтетазы
Ферменты, позволяющие
осуществить изменение
структуры концов фрагментов
ДНК (полинуклеотидкиназы,
экзонуклеазы, терминальная
трансфераза)

14.

Ферменты генной инженерии
Рестриктазы - эндонуклеазы рестрикции.
Это
ферменты,
узнающие
и
атакующие
определенные
последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции)

15.

Ферменты генной инженерии
Для большинства сайтов, узнаваемых рестриктазами типа II, характерно наличие в
них симметрии второго порядка: узнаваемые ими последовательности представляют
собой палиндромы, например у рестриктазы EcoRI – 5’-GAATTC-3’
Участки комплементарные
сами себе и друг другу,
взаимодействующие между
собой, называются
«липкими» концами.
В противном случае
образуются так
называемые «тупые»
концы.

16.

Ферменты генной инженерии.
ДНК-лигазы используют в генетической инженерии для сшивания
расщепленной цепи ДНК
Обычно используется ДНК-лигаза бактериофага Т4

17.

Ферменты генной инженерии
ДНК-полимеразы используются для построения комплементарных цепей,
достраивания липких концов, получения одноцепочечных молекул ДНК, при
ПЦР, обратной транскрипции, секвенировании и др.
Т4-ДНКполимераза
Pfu-полимераза
Taq-полимераза
Чаще всего применяются ДНК-полимераза I E. Coli,Т4-ДНК-полимераза,
термостабильные ДНК-полимеразы (Taq-полимераза и Pfu-полимераза)

18.

3. Разделение фрагментов ДНК по
размерам

19.

Разделение фрагментов ДНК по размерам
Гель-электрофорез
–
метод,
используемый
для
первоначального
разделения
полученных
в
результате
действия рестриктаз фрагментов ДНК

20.

Разделение фрагментов ДНК по размерам
Для электрофореза необходимы:
Камера для электрофореза
Агарозный гель, буферный раствор
Амплифицированная ДНК

21.

Разделение фрагментов ДНК по размерам

22.

4. Понятие о плазмидах и векторах

23.

Понятие о плазмидах и векторах
Векторы – молекулы-переносчики фрагментов нуклеиновых кислот.
Обязательные свойства
вектора
Вектор должен
длительное время
существовать в
популяции клетокхозяев
В векторе должны
быть биохимические
или генетические
маркеры
Структура векторной молекулы должна
допускать встраивание в нее чужеродной
последовательности нуклеотидов без
нарушения ее функциональной целостности

24.

Понятие о плазмидах и векторах
Плазмиды - небольшие молекулы нуклеиновых кислот, способные к
автономной репликации в бактериальных и эукариотических клетках.
Плазмиды
физически
отделены
от
геномных
хромосом и способны реплицироваться автономно.
Первые эффективные векторы для клонирования
фрагментов чужеродной ДНК, были получены с
использованием бактериальных плазмид.

25.

Понятие о плазмидах и векторах
Плазмиды средство горизонтального переноса генов

26.

Понятие о плазмидах и векторах
Получение векторов

27.

Понятие о плазмидах и векторах
Плазмида pBR322
(обязательные участки)
rep - место начала
репликации ДНК
ген amp, определяющий
устойчивость бактерий к
одному из антибиотиков,
ампициллину
ген tet, определяющий
устойчивость к еще
одному антибиотику,
тетрациклину
https://yandex.ru/images/search?img_url=https%3A%2F%2Fimage1.slideserve.com%2F2046230%2Fslide1l.jpg&lr=4&pos=7&rpt=simage&source=serp&text=pbr322%20плазмида

28.

Спасибо за внимание!