Длительное воздействие ионов марганца на поведение и серотониновую систему мозга рыб Danio rerio

1.

Длительное воздействие
ионов марганца на поведение
и серотониновую систему
мозга рыб Danio rerio
Исполнитель: Золотова Дарья Александровна
Научный руководитель: д.б.н., г.н.с.,
ФИЦ ИЦиГ СО РАН Куликов А.В
1

2.

Актуальность
Болезнь Паркинсона
второе по
распространенности
нейродегенеративное
заболевание в мире
2
Длительное воздействие марганца –
фактор риска паркинсоноподобных
синдромов у людей.
Серотониновая система задействована в
нескольких аспектах нейродегенеративных
заболеваний
Практически отсутствуют данные о
влиянии Mn на серотониновую систему
Белковые компоненты серотониновой
системы – потенциальная мишень для
ионов марганца
2

3.

Цель
изучение влияния длительного введения ионов Mn на серотониновую (5HT) систему головного мозга и контролируемые ею формы поведение у
рыб D. rerio.
Задачи на первом этапе работы
-
-
Освоить уход и принципы работы с D. rerio
Применить компьютерные методики для изучения поведения рыб
Освоить метод спектрофотометрического определения
концентрации ионов Mn в воде и тканях
Измерить уровень 5-НТ, его метаболита (5-HIAA), ключевых
ферментов его синтеза (триптофангидроксилаза) и окисления
(моноаминоксидаза) с помощью высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ)
Освоить выделение мРНК, синтез кДНК, количественную ОТ-ПЦР
реального времени
3

4.

Mарганизм - неврологическое расстройство
Марганизм в десятке ведущих
профессиональных заболеваний в Китае.
У 0.5%–2% рабочих на металлургических
предприятиях развивается марганизм.
Симптомы:
брадикинезия, ригидность, тремор,
постуральная неустойчивость,
психиатрические и когнитивные нарушения
(как и у болезни Паркинсона)
?
Mn
5-HT
система
тремор,
нарушения сна,
другие симптомы
?
заболевание
4

5.

5-HT система и D. rerio как модель
MnCl₂
Гомология с млекопитающими:
-
Анатомическая (Gaspar, Lillesaar, 2012)
Молекулярная (Panula et al., 2010)
Фармакологическая (Maximino et al., 2013;
Mn⁺²
Herculano, Maximino, 2014)
Экспозиция рыб в растворе MnCl2 приводит к накоплению ионов Mn
в структурах головного мозга D. rerio (Kulikov et al., 2019)
Описаны контролируемые 5-HT формы поведения (Maximino et al., 2013;
Herculano, Maximino, 2014)
5

6.

Биосинтез серотонина
декарбоксилаза
ароматических
аминокислот
триптофангидроксилаза
(5-гидрокситриптамин,
5-НТ)
(ТПГ)
L-триптофан
5гидрокситриптофан
серотонин
Лимитирующая стадия: ингибитор ТПГ, парахлорфенилаланин, снижает
уровень серотонина в мозге рыб (Куликова и др., 2021; Евсюкова и др., 2021)
6

7.

Катаболизм серотонина
моноаминоксидаза
(МАО)
серотонин
ацетальдегиддегидрогеназа
5-гидроксииндолальдегид
Фермент окисления 5-НТ
5-гидроксииндолуксусная
кислота
(5-HIAA)
Основной метаболит серотонина
7

8.

5-HT система млекопитающих и D. rerio
Mus musculus
Danio rerio
Mus musculus
Danio rerio
Tph1, Tph2
Tph1a, Tph1b, Tph2
Htr2c
Htr2cl1, Htr2cl2
Slc6a4
Slc6a4a, Slc6a4b
Htr3a, Htr3b
Htr3a, Htr3b
Maoa, Maob
Mao
Htr4
Htr4
Htr1a
Htr1aa, Htr1ab
Htr5a
Htr5aa, Htr5ab
Htr1b
Htr1b
Htr5b
-
Htr2a
Htr2aa, Htr2ab
Htr6
Htr6
Htr2b
Htr2b
Htr7
Htr7b, Htr7c
8

9.

5-HT зависимое поведение рыб
Верх
“Surface dwelling” при ингибировании
МАО или SERT и увеличении 5-HT в
синаптической щели
Более того, двигательная активность↓ при
↑5-HT и наоборот.
Дно
Тревожная реакция на
незнакомую и потенциально
опасную обстановку
9

10.

Эксперимент
4 группы рыб (n=20)
разная концентрация MnCl₂
1
Видеорегистрация в световой
период в постоянном аквариуме
Параметры:
- средняя скорость изменения
силуэта
- плотность рыб в верхней и
нижней ⅓ аквариума
Плотность соответствует времени
пребывания и скорость - пути.
0
100
200
500 мкмоль/л
2
Тест “Новый аквариум”
Параметры:
- пройденный путь
- среднее расстояние от дна
аквариума
- исследованная площадь, %
- время в нижней и верхней ⅓
резервуара
- время неподвижности
10

11.

План эксперимента
Содержание рыб в экспериментальных
аквариумах с видеорегистрацией
(по 12 ч в световой период)
Биохимический анализ
- ВЖЭХ
- ПЦР
10 дней
11-й день
Тест “Новый аквариум”
и вывод рыб из
эксперимента
Влияние ионов Mn на
белки 5-HT системы
in vitro
Анализ
результатов
11

12.

Биохимический анализ и статистика
Высокоэффективная
жидкостная хроматография
Уровени 5-HT (серотонин), 5HIAA (метаболит), активности
триптофангидроксилазы и
моноаминоксидазы
Экспрессия генов
Polr2eb - полимераза
ферменты Tph1a, Tph1b, Tph2
фермент катаболизма Mao
транспортер Slc6a4
рецепторы (Htr1aa, Htr2aa и др.)
Статистика
Биохимические параметры и результаты “Нового
аквариума” – однофакторный ANOVA тест
Суточная активность – Repeated measures ANOVA
12

13.

Заключение
Будет получена новая информация о:
1) молекулярных механизмах влиянии ионов
марганца на серотониновую систему;
1) влиянии ионов марганца на 5-HT зависимые
формы поведения рыб
1) нейротоксических эффектах ионов Mn
13