1. Фотометрические методы анализа

1.

Фотометрические методы
анализа

2.

Базовые понятия
- Фотометрия
- Длина волны (спектр поглощения)
- Оптическая плотность (абсорбция)
- Закон Бера
- Кривая реакции и ее типы

3.

Фотометрические методы анализа - методы
анализа, основанные на поглощении светового
излучения анализируемыми веществами.

4.

Спектрофотометрия — физико-химический метод исследования
растворов и твёрдых веществ, основанный на
изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм),
видимой (400—760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра
Основная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии, — зависимость
интенсивности поглощения падающего света от длины волны.
Колориметрия (от лат. color — «цвет» и греч. μετρώ — «измеряю») —
физический метод химического анализа, основанный на
определении концентрации вещества по интенсивности окраски
растворов
Анализ поглощения (турбидиметрия) и рассеяния (нефелометрия) световой
энергии взвешенными частицами анализируемого вещества.

5.

В зависимости от вида поглощающих частиц и
способа трансформирования поглощенной
энергии различают:
1. Атомно-абсорбционный анализ, основанный на поглощении
световой энергии атомами анализируемых веществ.
2. Молекулярный абсорбционный анализ, основанный на
поглощении световой энергии молекулами анализируемых
веществ в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной
областях спектра (спетрофотометрия, фотоколориметрия, ИКспектроскопия).
3. Анализ поглощения (турбидиметрия) и рассеяния
(нефелометрия) световой энергии взвешенными частицами
анализируемого вещества.
4. Люминесцентный (флуорометрический) анализ, основанный
на измерении излучения, возникающего в результате
выделения энергии возбужденными молекулами
анализируемого вещества.

6.

При фотометрических методах анализа молекулы
анализируемого вещества поглощают излучение только
при определенной длине волны света (спектр поглощения)
Длина волны — расстояние между двумя
ближайшими друг к другу точками в
пространстве, в которых колебания
происходят в одинаковой фазе

7.

Спектр поглощения — зависимость показателя
поглощения вещества от длины волны излучения,
связан с энергетическими переходами в веществе. Для
различных веществ спектры поглощения различны
Спектры поглощения
реагента (бланк) и
реагента с белком (В
06.03) смещены
относительно друг друга.
Величина ОП (абсорбции)
зависит от выбранной
длины волны
Длина волны должна быть
оптимальной, чтобы ОП
была максимальной

8.

Спектры поглощения света биомолекулами
А. ДНК
Б - сывороточный альбумин человека.
В - никотинамидадениндинуклеотид, окисленная и
восстановленная формы: NAD+ и NADH.
Г - гем, окисленная и восстановленная формы

9.

Основные закономерности
светопоглощения
Поглощение излучения характеризуют оптической
плотностью:
A = lg(I0/I),
где I0 – интенсивность падающего светового потока на
раствор анализируемого вещества,
I – интенсивность прошедшего светового потока.

10.

Закон Бугера-Ламберта-Бера
Оптическая
плотность
раствора
прямо
пропорциональна
концентрации
растворенного
вещества при постоянной толщине слоя:
Lg(I0/I) = k1×C (2),
где k1 – коэффициент пропорциональности
зависящий от природы растворенного вещества,
температуры, растворителя и длины волны света,
С – концентрация анализируемого вещества.

11.

Основные выводы
Фотометрические методы анализа - методы анализа основаны на
поглощении светового излучения анализируемыми веществами.
Спетрофотометрия, фотоколориметрия - анализ поглощения света
молекулами анализируемого вещества в ультрафиолетовой и видимой
областях спектра. Турбидиметрия - анализ поглощения света
взвешенными частицами анализируемого вещества.
В указанных методах фотометрического анализа (спетрофотометрия,
фотоколориметрия,
турбидиметрия)
поглощение
излучения
молекулами анализируемого вещества происходит при определенной
длине волны света, при которой поглощение будет максимальным
Поглощение излучения характеризуют оптической плотностью
Согласно закону Б-Л-Б, оптическая плотность раствора анализируемого
вещества пропорциональна концентрации вещества при постоянной
толщине слоя.

12.

Химическая реакция — превращение одного или нескольких
исходных веществ, при котором образуются новые химические вещества.
Конечная точка
Кинетическое измерение
Псевдокинетическое измерение

13.

Конечная точка
Реакция развивается
определенное время и
достигает конечного
состояния (конечной точки)
Детекция результатов анализа
(измерение ОП) происходит
после завершения реакции,
т.е. после выхода ОП на
постоянный уровень (на
«плато»)
Концентрация аналита
пропорциональна ΔА,
ΔА = Апробы-Абланка

14.

Кинетическое измерение
детекция результатов
анализа происходит во
времени протекания
реакции, т.е. детектируется
(измеряется) скорость
изменения ОП кривой
реакции (т.е. измеряется
скорость протекания
реакции) через равные
промежутки времени
Концентрация аналита
пропорциональна ΔА/мин

15.

Фиксированное время
(2-х точечная кинетика, псевдокинетика, 2 точки)
измеряется изменение ОП
кривой реакции в начале
интервала измерения и в
конце
Концентрация аналита
пропорциональна ΔА,
ΔА = А2-А1

16.

вопросы
На чем основаны фотометрические методы анализа
Что представляет собой оптическая плотность
О чем говорит закон Бугера-Ламберта-Бера
Чем отличается измерение по конечной точке от
кинетического измерения
Каков принцип реакции для наборов:
В 06.04, В 01.05, В 27.04, В 08.03, В 12.02, В 13.05

17.

Домашнее задание
Наборы из разделов Биохимия и Специфические
белки разделить на 3 группы по типу реакции:
конечная точка, кинетика, псевдокинетика