репликация

1. Лекция

Репликация ДНК.
Ферменты репликации

2.

Репликация ДНК — это процесс, посредством которого
клетка дублирует свою ДНК, передавая одну из копий своим
дочерним клеткам.
Репликация – способность к самокопированию, это одно
из основных свойств наследственного материала.
Вспомним, что удвоение молекул ДНК осуществляется
в синтетическом (S) периоде клеточного цикла,
После открытия Дж. Уотсоном и Ф. Криком структуры
молекулы ДНК было выдвинуто несколько гипотез о
возможном механизме протекания этого процесса
Репликация ДНК происходит полуконсервативным
способом, когда каждая дочерняя молекула ДНК содержит одну
материнскую и одну синтезированную цепь.

3.

Полуконсервативная репликация. В этой модели две нити ДНК
раскручиваются и отсоединяются друг от друга, далее каждая из них
выступает в качестве матрицы для синтеза новой комплементарной нити.
В результате чего получаются две молекулы ДНК, каждая из которых
содержит одну исходную и одну новую цепи.

4.

Согласно
гипотезе
консервативной
репликации
двухцепочечная материнская молекула ДНК как единое
целое служит матрицей для образования дочерней
молекулы, состоящей из двух совершенно новых цепей.

5.

Гипотеза дисперсной репликации состояла в том, что материнская ДНК
распадается на фрагменты, которые выступают в роли матриц для построения
отдельных участков новых молекул. Образованные таким способом молекулы
ДНК должны состоять из чередующихся фрагментов исходной молекулы и
вновь синтезированных.

6.

Эксперимент Мезельсона и Сталя
https://youtu.be/mw6bk6J2gTc

7.

В 1958 г. американские биологи М. Мезельсон и Ф. Сталь провели
экспериментальную проверку этих гипотез. На протяжении нескольких поколений
они выращивали бактерии (а именно кишечную палочку) в питательной среде,
содержащей «тяжелый» азот 15N. За это время 15N вошел в состав бактериальных
молекул ДНК. Далее бактерии были перенесены в среду, содержащую изотоп 14N.
Следовательно, в состав вновь синтезированных цепей ДНК включался уже
«легкий» азот. Из бактериальных клеток новых поколений, образовавшихся в среде
с 14N, выделяли ДНК и центрифугировали в градиенте плотности хлорида цезия .

8.

Выяснилось, что ДНК дочерних клеток первого
поколения имела плотность, среднюю между плотностью
«легкой» ДНК, содержащей только 14N, и «тяжелой»,
включающей только 15N. То есть такая «гибридная» ДНК
содержала одновременно 14N и 15N. Это противоречило
гипотезе о консервативном механизме репликации, согласно
которой ДНК должна была разделиться на две фракции —
«легкую» и «тяжелую».
ДНК, выделенная из клеток второго поколения,
разделялась на «легкую» и «гибридную». Этот факт полностью
соответствовал гипотезе полуконсервативной репликации и
позволил исключить дисперсный механизм удвоения ДНК,
согласно которому плотность ДНК второго поколения бактерий
должна быть средней между «легкой» и «гибридной». Таким
образом был доказан полуконсервативный механизм
репликации ДНК.*

9.

Процесс репликации
К настоящему времени установлено, что в осуществлении
репликации принимает участие целый комплекс ферментов.
Также известно, что этот процесс начинается в строго
определенных
участках
молекулы
ДНК
—
так
называемых точках начала репликации (origin of replication,
ori-сайт).
Бактериальная хромосома, как правило, имеет одну
такую точку.
У ядерных организмов каждая молекула ДНК
(хромосома) содержит множество точек начала репликации.
Следовательно, у эукариот процесс репликации одновременно
протекает на многих участках одной и той же хромосомы. Это
значительно сокращает время удвоения молекул ДНК.

10.

В процессе репликации ДНК участвует сложный
ферментный комплекс, включающий 15–20 белков-ферментов.
Выделяют белки, подготавливающие родительскую ДНК к
репликации, ферменты полимеризации, ферменты завершающие
репликацию ДНК.
Для осуществления репликации цепи материнской ДНК
должны быть отделены друг от друга, чтобы стать матрицами, на
которых будут синтезироваться комплементарные цепи дочерних
молекул.

11.

Процесс репликации ДНК подразделяют на три этапа:
инициацию, элонгацию и терминацию.

12.

Инициация репликации
Инициация репликации осуществляется в особых участках ДНК, обозначаемых
ori (от англ. оrigin - начало). Точки начала репликации на молекуле ДНК имеют
специфическую последовательность основании, богатую парами А-Т (двойную
водородную связь легче разорвать).
Процесс начинается с того, что с каждой такой последовательностью
связывается несколько молекул узнающих белков. Двойная спираль ДНК в этих
локусах, под действием фермента геликазы, разделяется на две цепи, при этом, как
правило, по обе стороны от точки начала репликации образуются области
расхождения полинуклеотидных цепей – репликационные вилки ( напоминает Y),
которые движутся в противоположных от локуса ori направлениях.

13.

Фермент геликаза разделяет нити двойной цепи ДНК. Образующиеся
при этом одинарные цепи ДНК связываются специальными
дестабилизирующими белками (SSB-белки), которые растягивают остовы
цепей, делая их азотистые основания доступными для связывания с
комплементарными нуклеотидами. Разделение спирально закрученных
цепей родительской ДНК ферментом геликазы вызывает появление
супервитков перед репликационной вилкой. Фермент топоизомераза I
разрывает одну цепь ДНК и дает возможность вращаться другой цепи,
тем самым ослабляет напряжение в двойной спирали ДНК.

14.

Элонгация репликации
Синтез цепи ДНК (полимеризацию нуклеотидной цепи) осуществляет ДНК-полимераза.
ДНК-полимераза присоединяет очередной нуклеотид в 3’ положении предшествующего
нуклеотида, цепь постоянно удлиняется на ее 3’ конце. Особенностью ДНК-полимеразы
является ее не способность начать синтез новой поленуклеотидной цепи путем простого
связывания
двух
нуклеозиттрифосфатов
необходим
3’-ОН-конец
какой-либо
полинуклеотидной цепи, спаренной с матричной цепью ДНК, к которой ДНК-полимераза
может лишь добавлять новые нуклеотиды.
Такую полинуклеотидную цепь называют затравкой или праймером. Роль затравки для
синтеза полинуклеотидных цепей ДНК в ходе репликации выполняют короткие
последовательности РНК, образуемые при участии фермента РНК-праймазы.

15.

Для начала синтеза новой цепи для ДНК-полимеразы необходимо наличие
свободного 3’-OH конца, к которому будет присоединен 5’-конец следующего
нуклеотида, т.е. необходимо наличие праймера (затравки) комплементарного
одной из материнских цепей. Для этого в точке начала репликации фермент
РНК-праймаза синтезирует короткую цепь РНК (РНК-затравка, или
праймер).
ДНК- полимеразы эукариот
ДНК-полимераза α выступает сначала в роли праймазы, синтезируя
праймер РНК, а затем как нормальная полимераза, присоединяя к этому
праймеру нуклеотиды. После того, как длина цепочки достигнет около 20
нуклеотидов, к синтезу ДНК приступают полимеразы δ и ε;
ДНК-полимераза β задействована в восстановлении ДНК;
Pol γ, осуществляющая репликацию митохондриальной ДНК;
ДНК-полимераза δ — основная полимераза эукариот. Она
высокопроизводительна, а также обладает 3'-5'-экзонуклеазным действием;
ДНК-полимераза ε, иногда замещающая ДНК-полимеразу δ во время
синтеза 3’-5’-моноспирали. Основное назначение этой полимеразы неясно;

16.

ДНК –полимеразы прокариот
ДНК-полимераза I задействована в восстановлении
ДНК, обладает и 5'-3', и 3'-5'-экзонуклеазным
действием;
•ДНК-полимераза II участвует в репарации
поврежденной ДНК. Обладает способностью 5'-3'удлинения
цепочки
и
3'-5'-экзонуклеазным
действием;
•ДНК-полимераза III — основная полимераза
бактерий, обладающая также 3'-5'-экзонуклеазным
действием;
•ДНК-полимераза IV, ДНК-полимераза семейства Y;
•ДНК-полимераза V, ДНК-полимераза семейства Y,
принимающая участие в пропуске поврежденных
участков ДНК.

17.

Поскольку синтез цепи ДНК возможен только в направлении 5’- 3’,
дочерние цепи ДНК в репликативной вилке синтезируются не с одинаковой
скоростью. Ферментный комплекс периодически прекращает образование
лидирующей цепи и переходит на вторую родительскую цепь и синтезирует
очередной фрагмент Оказаки запаздывающей цепи.
• Фрагменты Оказаки – короткие фрагменты отстающей цепи ДНК (с
РНК-праймером на 5’-конце – 100-200 нуклотидов).

18.

Терминация - конечный этап – завершение
репликации
Сшивание соседних фрагментов ДНК осуществляет ДНК
лигаза.
Этот
фермент
образует
межнуклеотидную
фосфодиэфирную
связь.
Молекула
ДНК
окажется
реплицированной не полностью, если не произойдет
специальный процесс репликации ее концов, или теломерных
участков. В этом процессе ключевую роль играет фермент
теломераза.
• Репликация заканчивается в участке гена (молекулы ДНК),
содержащим несколько специфических последовательностей
нуклеотидов, называемых терминационными сайтами. Это
короткие (около 23 пар нуклеотидов) последовательности.

19.

У эукариот проблема недорепликации – концов
линейных молекул
ДНК мешается с помошью
специального фермента – теломеразы, которая перед концом
репликации наращивает недорепликированные 5‘ – концы ДНК
дочерних
рибосом
короткими,
повторяющимися
последовательностями нуклеотидов или теломерами.
• Теломеры располагаются на концах хромосом. В состав
теломер входят специфические белки, не образующие
нуклеосомные глобулы в коротких теломерах.

20.

Теломеры и теломеразы
• Теломеры – концевые участки хромосом, которые не несут
генетической информации и защищают ДНК от расщепления нуклеазами,
и предотвращают от слияния.
• В результате репликации молекула ДНК окажется реплицированной не
полностью, если не произойдет репликации теломер. Существует
фермент,
восстанавливающий
длину
теломер
–
теломераза
(ДНКнуклеотидилтрансфераза). Теломераза есть только в зародышевых
клетках и клетках опухолей, в соматических клетках теломераза
отсутствует.

21.

Функции теломер:
• Участвует в фиксации хромосом к ядерному матриксу,
обеспечивая правильную ориентацию хромосом в ядре.
• Соединяют друг с другом концы сестринских хроматид,
образующихся в хромосоме после S – фазы. Структура
теломер однако допускает расхождение хроматид в анафазе.
Мутация гена теломеразной РНК с изменением
нуклеотидной последовательности теломер приводит к
нерасхождениию хромоатид.
• Предохраняют от недорепликации генетические
значимые отделы ДНК в отсутствие теломераз.

22.

Основные ферменты репликации
Фермент
Функция
ДНК-гираза
Вносит временные двуцепочечные разрывы в ДНК, облегчая её
разматывание.
Хеликаза
Разделяет цепи двухцепочечной молекулы ДНК на одинарные цепи.
SSB-белки
Связывают одноцепочечные фрагменты ДНК и предотвращают
комплементарное спаривание.
Праймаза
Синтезирует РНК-затравку (праймер) — короткий фрагмент РНК,
которая является инициатором в работе ДНК-полимеразы
(полимераза не способна синтезировать ДНК с нуля, но может
добавлять нуклеотиды к уже имеющимся).
ДНКполимераза
Синтезирует ДНК, связываясь с праймером. Следует отметить, что
один конец материнской ДНК полимераза синтезировала непрерывно
и в одном направлении, а второй — в противоположном —
фрагментами.
ДНК-лигаза
Сшивает фрагменты ДНК (фрагменты Оказаки.

23.

24.

25.

26. Значение репликации ДНК

1. Воспроизведение генетической информации при
размножении живых организмов.
2. Передача наследственных свойств из поколения
в поколение.
3. Развитие многоклеточного организма из зиготы.

27.

Глоссарий
«Репликационный глазок» образуется только в тех участках молекулы ДНК, в
которых
локализуется
специфические
нуклеотидные
последовательности,
получевшие название точек начала репликации, протяженностью около 300
нуклеотидов.
Точка начала репликации или сайт «О» (от англ – orign - начало) представляет
собой участок, с которого начинается репликация ДНК. Количество активных
репликанов (участков репликации ДНК) определяется генетической программой
организма.
ДНК полимераза - Синтезирует ДНК, связываясь с праймером. Следует отметить,
что один конец материнской ДНК полимераза синтезировала непрерывно и в одном
направлении, а второй — в противоположном — фрагментами.
Теломеры – концевые участки хромосом, которые не несут генетической
информации и защищают ДНК от расщепления нуклеазами, и предотвращают от
слияния.
Теломераза - Добавляет особые повторяющиеся последовательности нуклеотидов к
одному концу цепи ДНК на участках теломер, тем самым компенсируя их
укорачивание во время деления.
Полуконсервативность – каждая исходная (материнская) цепь ДНК выступает в
качестве матрицы для синтеза дочерней цепы. После репликации молекула молекула
ДНК содержит одну материнкую (старую) и одну дочернюю (новую) цепы. Дочерние
клетки, возникшие в результате деления материнской клетки, содержат одну
материнскую и одну дочернюю цепь в своей молекуле ДНК.

28.

Контрольные вопросы
1. Что такое репликация ДНК? Ее значение
2. Суть полуконсервативной репликации ДНК
3. Эксперимент Мезельсона и Сталя
4. Консервативный и дисперсионный механизмы
репликации
5. Инициация репликации
6. Элонгация репликации
7. Терминация репликации
8. Ферменты репликации
9. Проблема недорепликации концов
10.Теломеры и теломераза
11.Особенности репликации прокариот
12.Различия репликации прокариот и эукариот.

29.

Ссылка на видео
https://youtu.be/M_-UC_ww1F0
https://youtu.be/mw6bk6J2gTc