תרביות תאיםחלק6 (4)

1.

‫תרביות תאים בשירות הביוטכנולוגיה ‪ -‬ד"ר רות לנץ‬

2.

‫תרביות תאים בשירות הביוטכנולוגיה‬
‫מפגש ‪ – 8‬יחידת הוראה ‪8‬‬
‫גידול תרביות תאים של צמחים וסוגי תרביות‬
‫‪20:00 – 22:15‬‬
‫תרביות תאים בשירות הביוטכנולוגיה ‪ -‬ד"ר רות לנץ‬
‫‪2‬‬

3.

‫תרביות תאי צמחים ‪ -‬ראשי פרקים‬
‫‪ .1‬גידול תרביות תאי צמחים‪ ,‬סוגי תרביות ומחזור התא‬
‫‪ .2‬תשתית המעבדה וטכנולוגיות גידול של סוגי תרבית‬
‫‪ .3‬תחומי יישום של תרביות צמחיות במחקר ופיתוח‬
‫ובתעשייה‬
‫תרביות תאים בשירות הביוטכנולוגיה ‪ -‬ד"ר רות לנץ‬
‫‪3‬‬

4.

‫חשיבות גידול צמחים בתחומי החיים הבאים‪:‬‬
‫‪ .1‬מקור לתרופות ‪ -‬בתחום הרפואה‬
‫‪ .2‬מקור לתבלינים‪ ,‬פיגמנטים ולתוספי מזון ‪ -‬בתחום המזון‬
‫‪ .3‬מקור לתכשירים קוסמטיים ובשמים ‪ -‬בתחום הקוסמטיקה‬
‫‪ .4‬גידול תעשייתי‪-‬שיווקי של צמחים איכותיים – בתחום החקלאות‬
‫הקשיים הקיימים בחקלאות רגילה לצורך גידול התעשייתי ‪:‬‬
‫‪ .1‬תלות בגורמים סביבתיים ובמזיקים‬
‫‪ .2‬תלות בגורמים אקלימיים ובעונות השנה‬
‫‪ .3‬תלות בזמינות קרקע‪ ,‬השקיה ודישון‬
‫הפתרון‪:‬‬
‫גידול מסחרי בתרביות תאים במעבדה בביו‪-‬ריאקטורים בתנאים יציבים ומבוקרים‪.‬‬
‫תרביות תאים בשירות הביוטכנולוגיה ‪ -‬ד"ר רות לנץ‬
‫‪4‬‬

5.

‫בגידול מסחרי‪-‬תעשייתי של תרביות צמחיות במעבדה יש גם קשיים‪ ,‬כמו‪:‬‬
‫‪ .1‬רוב התוצרים הם מטבוליטים שניוניים הנוצרים בתום הגידול (ולא במהלך הגידול) ולכן‪,‬‬
‫תנאי הייצור המיטביים של התוצרים לא חופפים לתנאי הגידול‪.‬‬
‫‪ .2‬התוצרים הם תוך‪-‬תאיים‪ ,‬שלא מופרשים החוצה‪ ,‬כמותם בצמח קטנה וגם‪ ,‬דופן התא מקשה‬
‫על ההפקה‪.‬‬
‫‪ .3‬יש מגבלות גידול והתמיינות בתרבית כמו‪ :‬זמן הכפלה יחסית ארוך (‪ 2-5‬ימים) ‪ ,‬תלות‬
‫הייצור ביכולת התאים להתמיין לתאים בוגרים ויצרנים וגם‪ ,‬קיימת סכנה לאי יציבות גנטית‪.‬‬
‫למרות הקשיים יש יתרונות בגידול תאים בתרבית‬
‫‪ .1‬התנאים סטריליים‪ ,‬קבועים ומבוקרים‪.‬‬
‫‪ .2‬ניתן לשפר את קצב הגידול של התאים ואת קצב הייצור של התוצר בשיטות ביוכימיות‬
‫ובשיטות של הנדסה גנטית‪.‬‬
‫‪ .3‬ניתן לשפר את איכות התוצרים ואת כמותם בשיטות של הנדסה גנטית‪.‬‬
‫‪ .4‬ניתן להוזיל את עלויות הייצור על ידי הגברת יעילות הייצור‪.‬‬
‫תרביות תאים בשירות הביוטכנולוגיה ‪ -‬ד"ר רות לנץ‬
‫‪5‬‬

6.

‫סוגי תרביות‪-‬תאים צמחיות לגידול במעבדה‬
‫‪ .1‬תרבית קאלוס – תרבית תאים על מצע אגר מוצק‪.‬‬
‫‪ .2‬תרבית תרחיף תאים – תרבית תאים במצע נוזלי‪.‬‬
‫‪ .3‬תרבית תרחיף פרוטופלסטים – תרבית תאים חסרי דופן במצע נוזלי‪.‬‬
‫‪ .4‬תרבית מריסטמה – תרבית תאי גזע מריסטמיים מקודקוד צמיחה‪.‬‬
‫‪6‬‬

7.

‫התפתחות תרבית קאלוס על מצע אגר מזון מוצק‬
‫•‬
‫קאלוס ‪ -‬גוש‪/‬צבר לא מאורגן של תאים צעירים לא ממוינים‪ ,‬בעלי יכולת חלוקה וריבוי‪ .‬מקורם‬
‫ברקמת איחוי פצעים המצויה ברקמה בוגרת‪ .‬קאלוס מכיל תאי גזע בוגרים המצויים בכל רקמה‬
‫צמחית בוגרת (עלה‪ ,‬גבעול‪ ,‬שורש) ומתפתח זמנית בתגובה לפציעת הרקמה במטרה לשקם את‬
‫הרקמה הפצועה‪.‬‬
‫•‬
‫שחזור צמח בוגר‪ -‬ניתן לפתח בתרבית צמח בוגר שלם מקאלוס על ידי השראת תהליכי‬
‫התמיינות בתאי הקאלוס ורגנרציה לרקמה סומטית בוגרת‪ ,‬בתוספת הורמונים צמחיים‬
‫(ציטוקינינים ואוקסינים) המווסתים את הגידול ‪ ,‬עד כדי רגנרציה מלאה לצמח שלם‪.‬‬
‫‪7‬‬

8.

‫התפתחות‬
‫צמח בוגר מקאלוס‬
‫‪http://www.liv.ac.uk/~sd21/tisscult/introduction.htm‬‬
‫גידול הקאלוס על מצע מזון ‪ +‬מווסתי גידול (הורמונים צמחיים) יגרמו לתרבית קאלוס להתמיין‬
‫ולפתח ניצרון (ממנו מתפתח הגבעול) ושורשון (ממנו מתפתחים השורשים) ולייצר צמח שלם ‪.‬‬
‫תרביות תאים בשירות הביוטכנולוגיה ‪ -‬ד"ר רות לנץ‬
‫‪8‬‬

9.

‫השלבים בשחזור צמח בוגר שלם מתרבית קאלוס‬
‫השלבים בשחזור צמח שלם מתרבית קאלוס‬
‫שלב ‪ – 1‬בוחרים רקמת צמח בוגר (עלה‪ ,‬גבעול‪ ,‬שורש)‪ ,‬חותכים לפיסות קטנות וטובלים בחומר חיטוי‪.‬‬
‫שלב ‪ – 2‬מניחים את פיסות הרקמה על מצע מוצק ספציפי לרקמה לעידוד התחלקות התאים והתרבותם במצע‪.‬‬
‫שלב ‪ – 3‬התפתחות קאלוס מושרה מתאים סומטיים ברקמה בוגרת‪ .‬מבצעים פיצול והעברות לתת‪-‬תרביות לריבוי תאי‬
‫הקאלוס ולשמירה על חיותם‪ .‬הקאלוס מתקיים בנוכחות ריכוז מאוזן של ההורמונים הצמחיים אוקסין וציטוקינין (יחס‬
‫‪ .)1:1‬מכאן שבריכוזים שווים של שני ההורמונים‪ ,‬הקאלוס מתרבה אך לא מתמיין‪.‬‬
‫שלב ‪ – 4‬מאפשרים לקאלוס להתמיין ולפתח ניצרונים )‪ –Shoots‬גבעולים ירוקים קטנים) על ידי הוספת ריכוז גבוה‬
‫של ציטוקינין וריכוז נמוך של אוקסין כדי להצמיח גבעול ועלים (ביחס הגבוה מ‪ 1:10-‬לטובת הציטוקינין)‪.‬‬
‫שלב ‪ – 5‬מאפשרים המשך התמיינות לפיתוח שורשונים ( ‪ –Roots‬שורשים קטנים) על ידי הוספת ריכוז גבוה של‬
‫אוקסין וריכוז נמוך של ציטוקינין כדי להצמיח שורשים (ביחס הגבוה מ‪ 1:10-‬לטובת האוקסין)‪.‬‬
‫‪9‬‬

10.

‫שחזור צמח שלם בוגר מתרבית קאלוס בנוכחות הורמונים צמחיים‬
‫התמיינות רקמת קאלוס‬
‫התפתחות ניצרון ושורשון‬
‫ניצרון‬
‫שורשון‬
‫‪http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e29/29a.htm‬‬
‫‪12‬‬

11.

‫ההורמונים‬
‫מכוונים‬
‫להתמיינות‬
‫ולהתפתחות‬
‫צמחון ורגנרציה‬
‫לצמח בוגר שלם‬
‫בעודף‬
‫אוקסין ביחס‬
‫לציטוקינין‬
‫הקאלוס מתמיין‬
‫ומפתח שורשון‬
‫בעודף‬
‫ציטוקינין ביחס‬
‫לאוקסין‬
‫הקאלוס מתמיין‬
‫ומפתח נצרון‬
‫(גבעול)‬
‫בריכוז זהה של‬
‫ציטוקינין ואוקסין‬
‫הקאלוס גדל‬
‫ומתרבה אך לא‬
‫מתמיין‬
‫שחזור צמח בוגר מקאלוס לא מבטיח שהצמח המשוחזר יהיה זהה גנטית למקור או נקי מנגיפים‬
‫צמחיים ‪:‬‬
‫‪ .1‬תרבית קאלוס רגישה לזיהום נגיפי‪.‬‬
‫‪ .2‬תרבית קאלוס לא יציבה גנטית והתאים עוברים שינויים גנטיים ספונטניים הנקראים " וריאציות‬
‫סומקלונליות"‪ .‬השינויים הגנטיים אקראיים‪ ,‬בלתי צפויים ויכולים להיות לטובה או לרעה‪.‬‬
‫‪ .3‬השינויים הגנטיים בתכונות הצמח הבוגר יכולים לתרום ליצירת גיוון רחב של צמחים משוחזרים‬
‫בעלי תכונות חדשות ורצויות‪.‬‬
‫תרביות תאים בשירות הביוטכנולוגיה ‪ -‬ד"ר רות לנץ‬
‫‪11‬‬

12.

‫בידוד קו‪-‬תאים צמחי הומוגני וספציפי מתרבית קאלוס (העשרה)‬
‫‪ .1‬חיתוך – חותכים את גוש הקאלוס לתת‪-‬גושים בצורת קוביות קטנות‪.‬‬
‫‪ .2‬הפרדה וגידול – מפרידים בין תת‪-‬הגושים של הקאלוס ומגדלים כל קוביית קאלוס בנפרד על‬
‫מצע מוצק בכלי גידול נפרד‪.‬‬
‫‪ .3‬סריקה – סורקים את התרביות של כל תת‪-‬גוש לאיתור ולקביעה של התכונה הרצויה של התאים‬
‫(לדוגמה‪ :‬ייצור‪-‬יתר של תוצר ספציפי רצוי)‪.‬‬
‫‪ .4‬בחירה – בוחרים בתרבית הקאלוס (תת‪-‬הגוש) הרצויה (לדוגמה‪ :‬קו‪-‬תאים שהוא יצרן‪-‬יתר של‬
‫תוצר‪.‬‬
‫‪ .5‬אחסון בבנק תאים – מקפיאים תאים מקו‪-‬התאים (תת‪-‬הגוש) הרצוי בבנק תאים‪ .‬לשימוש עתידי‪.‬‬
‫תרביות תאים בשירות הביוטכנולוגיה ‪ -‬ד"ר רות לנץ‬
‫‪12‬‬

13.

‫תרבית תרחיף תאים צמחיים במצע מזון נוזלי‬
‫מתרבית קאלוס (לא ממוין) ניתן לקבל תרחיף תאים צמחיים בתוך מצע מזון נוזלי על ידי העברה‬
‫של גוש הקאלוס למצע מזון נוזלי‪ ,‬עם טלטול‪ ,‬לפירוק מכאני של גוש התאים לתאים בודדים‪.‬‬
‫התאים מתרבים בתרחיף בצורת תאים בודדים או צברים קטנים‪ .‬בנוסף‪ ,‬הטלטול מונע את שקיעת‬
‫התאים וגם תורם לפיזור אחיד של המזון והחמצן במצע הנוזלי‪.‬‬
‫בתרבית תרחיף‪ ,‬התאים מתרבים בקצב מהיר ויש צורך בפיצול התרבית לתת‪-‬תרביות או בהעברת‬
‫התרבית לביוריאקטור לגידול כמותי בקנה‪-‬מידה מסחרי‪.‬‬
‫ניתן להכין תרחיף תאים צמחיים גם ישירות מרקמת עלה של צמח על ידי פירוק רקמת החיבור בין‬
‫התאים והפרדת התאים לתאים בודדים אך‪ ,‬בשיטה זו סכנת הזיהום גדולה יותר‪.‬‬
‫תרביות תאים בשירות הביוטכנולוגיה ‪ -‬ד"ר רות לנץ‬
‫‪13‬‬

14.

‫תרבית תרחיף פרוטופלסטים צמחיים במצע מזון נוזלי‬
‫מתרבית תרחיף התאים ניתן לקבל תרחיף פרוטופלסטים צמחיים (תאים צמחיים ללא דופן) על ידי‬
‫העברה של תרחיף התאים למצע מזון נוזלי‪ ,‬המכיל אנזימים הפרקים את דופן התא כדוגמת‪,‬‬
‫צלולאז המפרק את הצלולוז של דופן התאים‪.‬‬
‫תרבית פרוטופלסטים רגישה מאוד לשינויים אוסמוטיים בגלל העדר דופן התאים ולכן‪ ,‬חשוב‬
‫לשמור על לחץ אוסמוטי איזוטוני תקין וטלטול עדין‪ .‬פרוטופלסטים יכולים לחדש את בניית דופן‬
‫התא תוך ‪ 2-4‬ימים‪ ,‬לחזור להיות תאים רגילים‪ ,‬להתחלק ולהתרבות במצע הנוזלי או על מצע‬
‫מוצק‪ .‬יצירה מחדש של דופן התא חיונית לחלוקת התאים במיטוזה‪.‬‬
‫הפרוטופלסטים חשובים ביצירת שינויים גנטיים‪ ,‬בתהליכי איחוי ומיזוג )‪ )fusion‬של תאים ליצירת‬
‫תא כלאיים גנטי (היבריד צמחי בעל תכונות גנטיות חדשות)‪ .‬מתאי כלאיים גנטיים‪ ,‬שגודלו על מצע‬
‫אגר מוצק‪ ,‬ניתן לפתח קאלוס וממנו לשחזר בנוכחות הורמונים צמחיים‪ ,‬צמח היברידי בוגר בעל‬
‫תכונות חדשות‪.‬‬
‫‪14‬‬

15.

‫סיכום‪ -‬שחזור צמח שלם מתרביות תאים צמחיים‬
‫תרביות תאים בשירות הביוטכנולוגיה ‪ -‬ד"ר רות לנץ‬
‫‪15‬‬

16.

‫‪ .4‬תרבית מריסטמה על מצע אגר מזון מוצק (‪) Meristem Cell Culture‬‬
‫בניגוד לקאלוס‪ ,‬המושרה זמנית ברקמה בוגרת‪-‬סומטית‪ ,‬קיימת בצמח רקמה עוברית קבועה‪,‬‬
‫המכילה תאי גזע עובריים‪ ,‬והיא‪ ,‬רקמת המריסטמה‪ .‬תאי מריסטמה מתחלקים כל הזמן ויש להם‬
‫יכולת של חידוש עצמי ויכולת התמיינות ורגנרציה של צמח בוגר שלם‪ .‬בנוסף‪ ,‬תאי מריסטמה‬
‫מתאפיינים ביציבות גנטית ובעמידות לנגיפים‪ .‬לכן‪ ,‬תרבית זו משמשת למיקרו‪-‬ריבוי מסחרי של‬
‫צמחים‪ ,‬הזהים גנטית לצמח המקור‪ ,‬ללא מוטציות סומקלונליות‪ ,‬וגם נקיים מנגיפים‪.‬‬
‫רקמת מריסטמה עוברית נמצאת בקוקודי הצמיחה של השורש )‪ )Root‬של הגבעול והעלים‬
‫(‪ )Shoot‬ובצינורות ההובלה של הצמח‪.‬‬
‫מרקמת מריסטמה – ניתן לשחזר צמח שלם זהה גנטית לצמח המקור וגם נקי מנגיפים‪.‬‬
‫‪16‬‬

17.

17

18.

18

19.

‫מחזור התא וגרף הגידול של אוכלוסיית תאי הצמח בתרבית תרחיף‬
‫גרף הגידול של תאי הצמח בתרבית דומה לגרף הגידול של תאי בעלי חיים ומורכב מארבעה‬
‫שלבים‪:‬‬
‫‪ .1‬שלב הסתגלות התאים לתנאי הגידול טרום החלוקה (‪.)Lag Phase‬‬
‫‪ .2‬שלב הגידול המעריכי (אקספוננציאלי) על ידי חלוקת התאים במיטוזה ( ‪)Log Phase‬‬
‫‪ .3‬שלב העמידה וההתייצבות הסטציונרי )‪)Stationary Phase‬‬
‫‪ .4‬שלב הירידה בגידול ותמותת תאים )‪)Decline/Death Phase‬‬
‫מונעים את שלב התמותה על ידי פיצול והעברה לתת‪-‬תרביות חדשות עם מצע טרי בסיום שלב הגידול המעריכי‪.‬‬
‫‪19‬‬

20.

‫העשרה‪ :‬השלב השונה בין התאים הצמחיים לתאי בעלי חיים הוא‬
‫השלב האחרון‪ ,‬שלב הציטוקינזה‪ .‬בשלב הציטוקינזה‪ ,‬מופיעה‬
‫בציטופלסמה של התא הצמחי מחיצה בצורת לוחית‪-‬תא ‪Cell‬‬
‫‪ Plate‬הנוצרת מצלולוז ומופרשת משלפוחיות‪.‬‬
‫לוחית התא מופיעה במרכז התא ומפרידה בין שני תאי הבת‪.‬‬
‫בהמשך‪ ,‬כל תא ממשיך בנפרד לעבות את דופן התא עד לעובי‬
‫המקורי הנדרש‪.‬‬
‫‪20‬‬

21.

‫העשרה‬
‫‪21‬‬

22.

‫סביבת העבודה ותנאי הגידול‬
‫‪22‬‬

23.

23

24.

24

25.

25

26.

‫ביוריאקטורים‬
‫מיכלים‬
‫לגידול מסחרי‬
‫של תרביות‬
‫צמחיות‬
‫‪26‬‬

27.

‫משימת מפגש ‪ – 8‬יחידת הוראה ‪8‬‬
‫בספר – עמוד ‪ :78‬לענות על שאלה ‪ 7‬בספר‪.‬‬
‫‪27‬‬

28.

‫‪ .7‬תרגיל התאמה – לפניכם רקמת קאלוס ורקמת מריסטמה‪ .‬התאימו לכל רקמת תאים את המאפיינים המבדילים בין שתי‬
‫הרקמות מתוך רשימת המאפיינים‪:‬‬
‫רשימת מאפיינים‪ :‬מקור עוברי‪ ,‬מקור סומטי‪ ,‬תא גזע קבוע‪ ,‬תא גזע מושרה‪ ,‬רקמה זמנית‪ ,‬רקמה תמידית‪,‬‬
‫רקמה אחידה‪ ,‬רקמה לא אחידה‪ ,‬יציבה גנטית‪ ,‬רגישה גנטית‪ ,‬עמידה לנגיפים‪ ,‬רגישה לנגיפים‪.‬‬
‫‪28‬‬

29.

‫מטלת סיום הקורס‪:‬‬
‫מטלת הסיום ‪ :‬לחבר מבחן ‪ +‬מחוון על אחד הנושאים שנלמדו בהשתלמות (בתאי בעלי חיים או בתאי צמחים) –‬
‫הכולל‪:‬‬
‫•‬
‫‪ 5‬שאלות רבות ברירה ‪ +‬שאלה פתוחה גדולה אחת המורכבת מ ‪ 3‬סעיפים‪.‬‬
‫•‬
‫לפי דרישת פסג"ה יש לצרף ‪:‬‬
‫רפלקציה על הידע החדש הנלמד בהשתלמות‪ ,‬תובנות חדשות או רעיון ליישום החומר הנלמד בקורס‪.‬‬
‫בביליוגרפיה (מקורות עזר) ‪ -‬חלקם נשלחו במטלות האסינכרוניות וחלקם מופיעים באתר הספר תרביות תאים‪.‬‬
‫תרביות תאים בשירות הביוטכנולוגיה ‪ -‬ד"ר רות לנץ‬
‫‪29‬‬