през. Антибиотики. Холоднова

1.

Антибиотикорезистентность
почвенных бактерий
как следствие экологического
загрязнения
Выполнила:
Холоднова Мария Константиновна,
ученица 11 класса
Руководитель:
Васильцова Оксана Николаевна,
учитель биологии
Научный консультант:
Эйдельштейн Инна Александровна,
к.б.н., НИИ антимикробной химиотерапии ГОУ ВПО СГМУ

2.

Актуальность работы
Осведомленность населения о том, что избыток
поступления антибиотиков в организм ведет к
развитию устойчивости бактерий.
Из-за этого люди нацелены на потребление
органической пищи, не содержащей антибиотики,
ядохимикаты, пестициды, для поддержания
собственного здоровья.
Если есть спрос, значит, есть предложение на
рынке.

3.

Актуальность работы
Антибиотики попадают в почву из:
Сельскохозяйственных стоков
Сточных вод
Промышленных отходов
Навоза, в качестве удобрений

4.

Цель:
изучить
показатели
антибиотикорезистентности
почвенных
бактерий в разных пробах.
Задачи:
1. Отбор проб почв в разных частях города Смоленска для исследования.
2. Изучение видового состава сообщества почвы из взятых проб.
3. Определение антибиотикорезистентности почвенных бактерий.
Гипотеза: попадание антибиотиков в окружающую среду приводит к
развитию антибиотикорезистентности почвенных бактерий.

5.

Устойчивость к антибиотикам
Антибиотикорезистентность - это способность микроорганизмов (в данном случае
почвенных бактерий) противостоять действию антибиотиков, которые обычно их
убивают или подавляют.
Микроорганизмы, обладающие природной
устойчивостью получают преимущество в
выживании и размножении, что способствует
распространению устойчивых штаммов.
К механизмам устойчивости бактерий относят
вырабатывание ферментов, разрушающих
антибиотики, изменение структуры своих
клеточных стенок, чтобы антибиотик не мог
проникнуть внутрь.

6.

Сбор биологического материала
Районы сбора проб почв
(https://yandex.ru/map-constructor/)

7.

Сбор биологического материала
Реадовский парк.
Контрольная группа
р. Ясенная

8.

Сбор биологического материала
Областная клиническая
больница
д. Сметанино

9.

Методика микробиологического анализа
образцов почв
1. Подготовка образцов.
2. 1г образцов почвы
поместили в 5мл стерильного
физраствора, встряхнули.
Провели пятикратное
разведение 10-5.
Пробы почв
3. Посев на питательную среду
методом истощающего штриха до
отдельных колоний. Получилось
16 чашек Петри.
Пробирки с разведенной
физрастворе почвой
в
Посев проб методом
истощающего штриха

10.

Методика микробиологического анализа
образцов почв
4. Поместили в термостат на
24 часа при температуре +35о.
Термостат
5. Определение видового
разнообразия
выросших
колоний микроорганизмов с
помощью масс-спектрометра
(Microflex).
Масс-спектрометр
(Microflex)

11.

Результаты микробиологического анализа
образцов почв
Видовое разнообразие микрофлоры исследуемых образцов почв
Место сбора почв
Видовой состав
д. Сметанино
(Smet)
Acinetobacter soli, Acinetobacter johnsonii, Bacillus sp., Acinetobacter kookii,
Acinetobacter oleivorans, Chryseobacterium gleum, Acinetobacter lwoffii,
Bacillus cereus (1 образец не определен)
Итого определенных видов в образце: 8
Смоленская
Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter kookii, Acinetobacter lwoffii,
Областная
Exiguobacterium acetylicum, Acinetobacter johnsonii, Exiguobacterium sp
Клиническа больница
Итого определенных видов в образце: 6
(SOKB)
Парк Реадовка (Read) Klebsiella oxytoca, Acinetobacter tandoii, Exiguobacterium sp., Acinetobacter
lwoffii, Acinetobacter johnsonii, Leclercia adecarboxylata, Acinetobacter kookii
Итого определенных видов в образце: 6
р. Ясенная,
Klebsiella oxytoca, Acinetobacter tandoii, Exiguobacterium sp., Acinetobacter
ул. м. Соколовского lwoffii, Acinetobacter johnsonii, Leclercia adecarboxylata, Acinetobacter kookii
(YASEN)
Итого определенных видов в образце: 7
Вывод: наибольшее видовое разнообразие микроорганизмов в исследуемых образцах почв
определено в образце в д. Сметанино, возле птицефабрики.

12.

Методика системы-IMP, анализ ПЦР
1. В работе использована коммерческая система ДНК-сорб АМ
«Интерлабсервис».
Набор реактивов
(https://www.interlabservice.ru/catalog/reagenty/ptsr-diagnostika/vydelenie-iochistka-nukleinovykh-kislot-i-belkov/dnk-sorb-am-forma-5-s-kontrolyami.html)
2. Для анализа 100 мкл почвенной суспензии в физиологическом
растворе вносятся в систему.
3. Образец анализируется двумя мультиплексными ПЦР-смесями
параллельно:
смесь FL IMP-1 (4 канала детекции),
смесь FL IMP-2 (3 канала детекции).
4. Анализ графиков накопления
флуоресцентного сигнала.
Амплификатор
детектирующий Дтпрайм
(https://dna-technology.ru/dnaproducts/equipments/rtamplificators/dt_prime)

13.

Методика системы-IMP, анализ ПЦР
Для ПЦР-смеси-FL IMP-1:
1. По каналу FAM регистрируется сигнал c фрагментом ДНК Escherichia coli;
2. По каналу НЕХ регистрируется сигнал с фрагментом ДНК Klebsiella pneumoniae;
3. По каналу ROX регистрируется сигнал с ДНК ВКО (контроль);
4. По каналу Су5 регистрируется сигнал с фрагментом ДНК Pseudomonas aeruginosa.
Для ПЦР-смеси-FL IMP-2:
1. По каналу FAM регистрируется сигнал c фрагментом ДНК Enterobacterales;
2. По каналу НЕХ регистрируется сигнал с фрагментом ДНК Enterococcus spp;
3. По каналу ROX регистрируется сигнал с ДНК ВКО (контроль);
4. Данные по каналу Су5 не учитываются.

14.

Результаты системы-IMP
Результат системы IMP-1
Образцы
Образец-1
Название образца
СОКБ
Образец-2
д. Сметанино
Образец-3
р. Ясенная
Образец-4
Парк Реадовка
Результаты системы
FAM – Escherichia coli
HEX – Klebsiella pneumoniae
FAM – не определено
HEX- не определено
FAM – Escherichia coli
HEX – не определено
FAM – не определено
HEX – Klebsiella pneumoniae

15.

Результаты системы-IMP
Результат системы IMP-2
Образцы
Образец-1
Название образца
СОКБ
Результаты системы
FAM – Enterobacterales
HEX- не определено
FAM – Enterobacterales
HEX – Enterococcus spp
Образец-2
д. Сметанино
Образец-3
р. Ясенная
FAM – Enterobacterales
HEX- не определено
Образец-4
Парк Реадовка
FAM – Enterobacterales
HEX – Enterococcus spp
Вывод: обнаружены Escherichia coli во всех образцах, Klebsiella pneumoniae в образцах СОКБ, парка
Реадовка, кроме р. Ясенной и д. Сметанино и Enterococcus spp в образцах д. Сметанино и парка Реадовка.

16.

Методика определения системы БакРезиста
1. Выделяется мета-ДНК.
2. Осуществляется подготовка ПЦР-смеси на основе набора
«БакРезиста GLA».
Коммерческая тест-система
БакРезиста GLA (ДНК-Технологии)
3. Стрипы помещаются в детектирующий ПЦР-амплификатор.
4. Анализ результатов в виде графиков и таблиц.
Стрипы для определения
антибиотикорезистентности

17.

Результат определения системы БакРезиста
Вывод: в образце р. Ясенная обнаружены ОХА-23-like (канал-FAM) и ndm (канал Су5).

18.

Общие выводы
1. В исследуемых образцах обнаружено наибольшее количество микроорганизмов рода
Acinetobacter – грамотрицательных бактерий из семейства Moraxellaceae, которые характерны
для почвенного биома, но некоторые виды являются условно-патогенными для человека.
2. У бактерии рода Acinetobacter обнаружен механизм резистентности ОХА-23 в образцах почв
берега р. Ясенной (ул. м. Соколовского), которая обусловлена природной устойчивостью к
антибиотикам.
3. В образцах почв берега р. Ясенной обнаружен NDM-фермент, который придает
антибиотикорезистентность даже к карбапенемам.
4. В образце почвы с берега р. Ясенная обнаружены антибиотикорезистентные ферменты, что
свидетельствует о наличии канализационных стоков, а так как водоем является открытым и
расположен возле жилых домов, следовательно, является опасным для человека.
5. Во всех образцах почв обнаружены Escherichia coli, что доказывает фекальные загрязнения.
Особенно это актуально для парка Реадовка, который является рекреационной зоной для
жителей города Смоленска.

19.

Рекомендации
1. Канализационные стоки не должны попадать в открытый водоем
(р. Ясенная, которая впадает в р. Днепр), что может вызвать
распространение антибиотикорезистентных организмов в окружающей
среде.
2. Р. Ясенная требует внимание со стороны администрации г. Смоленска,
так как является местом несанкционированной свалки бытового мусора.
3. Необходимо проведение разъяснительных мероприятий для владельцев
собак о правилах соблюдения выгула собак в общественных местах,
которые предусматривают уборку экскрементов за своим питомцем.

20.

Спасибо за внимание!