Модели биологических мембран и липидов

1.

ВИДЫ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ
ИСКУССТВЕННЫХ МЕМБРАН
1. Модельные липидные мембраны.
2. Способы формирования искусственных липидных
мембран.
3. Значение для исследования

2.

Модели биологических мембран
Монослой
липидов
Бислой
липидов
Липосома

3.

1. Липидные монослои – простейшие
модели биомембран
Расположение молекул липидов (А – димиристоилфосфатидилхолин, Б – цереброзид) в монослое на водной поверхности

4.

Липидные монослои позволяют
оценивать площадь, приходящуюся на
молекулу липида в монослоях клеточных
мембран;
изучать сорбцию отдельных мембранных
компонентов, включая белки;
устанавливать взаимодействие между ними в
ориентированных мономолекулярных
структурах, имитирующих поверхность раздела
клеточная мембрана – вода;
изучать структурно-динамические свойства
монослоев в зависимости от их липидного
состава.

5.

Наибольший вклад в исследование
мономолекулярных пленок, образованных
нерастворимыми в воде соединениями,
внес И.Ленгмюр (1917 – 1920 гг.).
Эти пленки и метод их формирования и
исследования носят его имя.
Ирвинг
Ленгмюр
1881 - 1957
Ленгмюр установил, что молекулы в
липидных мономолекулярных пленках
ориентированы таким образом, что их
гидрофильные участки находятся в контакте
с водным раствором, а гидрофобные –
направлены в сторону воздуха.

6.

Для формирования на поверхности водной фазы
монослойной липидной пленки используется ванна
Ленгмюра.
Схематическое представление состояния липидных молекул
в монослое на границе воздух – водная поверхность.

7.

Схематическое изображение ванны и весов Ленгмюра.
1 — кювета; 2 — барьер; 3 — весы; S — площадь, занятая
слоем липида

8.

а) двумерный газ
б) двумерная жидкость
в) твердый монослой

9.

0
Общий вид кривой сжатия монослоя на водной
поверхности и состояния липидных молекул на границе
липид – водный раствор.
А – двумерный газ, Б – растянутая жидкость, В – растянутая
жидкость и сжатая жидкость, Г – твердая фаза, Д – коллапс,
разрушение пленки.

10.

При малой концентрации молекул на поверхности субфазы
они находятся в состоянии "двумерный газ" (А). При
уменьшении приходящейся на молекулу липида площади
(путем смещения барьера или увеличения концентрации
липида без изменения занимаемой монослоем площади)
увеличение поверхностного давления в монослое приводит
к образованию упорядоченных монослойных липидных
пленок (Б, В). По мере сжатия жирнокислотные цепи
принимают все более вытянутую форму, переходя, в конце
концов, в полностью транс конфигурацию. Пленка
становится «твердой», т.е. почти несжимаемой ( область Г).
При попытке еще больше сжать пленку, монослой
разрушается, превращаясь в многослойную структуру
(коллапс).

11.

Поведение липидных молекул в монослое
существенно зависит от их строения.

12.

Насыщенные жирные кислоты образуют конденсированные
монослои при поверхностном давлении 10-4Н/см.
Площадь, приходящаяся на одну молекулу в монослое не зависит
от длины углеводородной цепи и при максимально плотной
упаковке монослоя, отвечающей давлению коллапса, составляет
0,19—0,2 нм2

13.

Введение одной двойной
связи в жирнокислотную
цепь существенно
увеличивает площадь,
приходящуюся на
молекулу.
Например, для
олеиновой кислоты
предельная площадь
возрастает до 0,26—0,27
нм2.

14.

Введение дополнительных
двойных связей мало влияет на
площадь, приходящуюся на одну
молекулу жирной кислоты.

15.

2.Плоские бислойные липидные мембраны
Первые искусственные плоские бислойные
липидные мембраны были созданы в 1936 г.
Через 30 лет Мюллер и Рудин смогли получить
стабильные плоские липидные бислои, с помощью
которых можно было воспроизвести и изучить
многие свойства биологических мембран.

16.

А – приспособление, использованное в первых работах П.Мюллера и
соавторов. Внутри стеклянного сосуда находится полиэтиленовый
стаканчик с отверстием, края которого тщательно отшлифованы.
Фосфолипидная мембрана формируется на этом отверстии из
наносимого на него кистью или тонкой пипеткой раствора липидов;
Б – приспособление для формирования сферических мембран
(диаметр шара может достигать 1 см)

17.

а — ячейка для получения БЛМ и изучения ее свойств; б и в—
последовательные этапы формирования БЛМ; 1 — фторопластовый
стаканчик; 2 — отверстие в стенке стаканчика; 3 — электроды; 4 —
вольтметр

18.

19.

Процесс формирования БЛМ

20.

Схема формирования БЛМ из двух монослоев
Этот способ впервые
был предложен
японскими
исследователями
(М. Такаги и сотр., 1965)
и впоследствии был
усовершенствован М.
Монталом (1972—1974).
Преимущество метода
формирования БЛМ по М.
Монталу: возможность
получения асимметричных
мембран из исходных
монослоев разного
липидного состава.

21.

Время жизни БЛМ от нескольких минут до 1-3 часов
Нестабильность
бислойных
разнообразные факторы:
мембран
вызывают
наличие нежелательных примесей в образце,
окисление липидов,
загрязнение оборудования и посуды,
неподходящий для формирования растворитель,
колебания температуры,
вибрация,
резкие перепады концентрации и вязкости среды.

22.

Образование сферической БЛМ
Образующийся липидный бислой обладает исключительно высокой
механической прочностью и эластичностью.

23.

Схема экспериментальной установки для изучения БЛМ
Эта модельная система подходит для измерения электрических
характеристик липидного бислоя, таких, как электрическая емкость,
проводимость, мембранные потенциалы.

24.

25.

Образование
белоксодержащих
БЛМ путем
слияния липосом с
плоским бислоем

26.

Модельные бислойные липидные мембраны по
свойствам близки к биологическим, что позволяет
рассматривать их в качестве адекватной модели
биомембран.
С помощью плоских бислойных липидных
МЕМБРАН исследуют
механические свойства мембран,
электрохимические свойства границы раздела
липидный матрикс – раствор электролита,
адсорбцию заряженных частиц.
свойства встроенных в бислои транспортных
систем клеточных мембран.
Липидные бислои позволяют вводить в них
соединения, формирующие транспортные системы:
ионные каналы, переносчики веществ и энергии.

27.

28.

3. Липосомы
А.Бэнгхем (р. 1921),
английский биофизик.
Липосомы – липидные
сферические пузырьки
( везикулы) с
внутренним водным
объемом.
В 1963 г. А.Бенгхем впервые продемонстрировал, что диспергированные
в воде фосфолипиды гидратируются и образуют структуры в виде
концентрических тонких слоев, ламелей. Каждая ламель – липидный
бислой.

29.

Согласно размера одноламелярные липосомы разделяют на три
вида:
малые (диаметром от 20 до 50 нм),
крупные (диаметром от 50 до 100 нм)
гигантские (диаметром от 5000 до 100000 нм).
Микрофотографии многослойных липосом, образовавшихся из
фосфатидилхолина:
(а) — негативное контрастирование молибдатом аммония;
(б) — «замораживание — скалывание»

30.

31.

Малые и крупные липосомы готовят из
растворов липидов в органических
растворителях (например, из смеси хлороформа
и метанола).
Затем растворители выпаривают в вакууме до
образования тонких липидных пленок.
Высушенные пленки гидратируют в
соответствующем буфере.
Сначала пленке дают время набухнуть, а затем
суспензию подвергают встряхиванию.
Получившуюся таким способом суспензию
мультислойных липосом обрабатывают
ультразвуком.

32.

33.

Сравнительно гомогенную дисперсию липосом можно
получать, пропуская их через фильтры с определенным
размером пор.

34.

Липосомы широко используются для выяснения
барьерной функции липидов и для моделирования
различных транспортных процессов.
Методы изучения проницаемости липосом:
1) методы, основанные на прямом измерении
количества какого-либо вещества, вышедшего из
липосом за определенный промежуток времени
(используют изотопы);
2) методы, основанные на осмотических свойствах
липосом.

35.

Как модели, липосомы значительно ближе к
биологическим мембранам, чем бислойные
липидные пленки, т.к.
представляют собой замкнутые системы, что
делает их пригодными для изучения пассивного
транспорта ионов и малых молекул через липидный
бислой;
достаточно стабильны;
не содержат органических растворителей;
состав липидов в липосомах можно произвольно
варьировать и таким образом направленно
изменять свойства мембраны.

36.

ЭТАПЫ:
Разработаны методы включения
функционально активных
мембранных белков в липосомы
(реконструкция белков) – создание
искусственных белково-липидных
структур – протеолипосом.
СОЗДАНИЕ ЛИПОСОМ
ВСТРАИВАНИЕ В НИХ БЕЛКОВ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ
АКТИВНОСТИ БЕЛКОВ

37.

Протеолипосомы используют для
моделирования различных ферментативных,
транспортных и рецепторных функций
клеточной мембраны;
изучения действия различных веществ
(лекарств, витаминов, гормонов,
антибиотиков) на мембраны;
доставки препаратов в определённые клетки.

38.

Благодаря
возможности
реконструкции
мембраны из ее
основных
компонентов
удается
моделировать
ферментативные,
транспортные и
рецепторные
функции
клеточных
мембран.

39.

В липосомы можно ввести антигены, а также ковалентно
присоединить антитела и использовать их в иммунологических
исследованиях.
Они представляют собой удобную модель
для изучения действия многих лекарственных веществ, витаминов,
гормонов, антибиотиков и т. д.
Ковалентное присоединение антител к липосомам.

40.

Медицинское применение липосом в качестве средства доставки
различных лекарственных препаратов в определенные органы и ткани
с целью воздействия на целый организм.
Полученные из природных
фосфолипидов
липосомы в отличие от полимерных
систем доставки лекарств полностью
биодеградируемы и биосовместимы,
пригодны для включения в них многих
фармакологических агентов, в том
числе ферментов, гормонов,
витаминов,
антибиотиков, иммуномодуляторов,
цитостатиков.

41.

42. Свойства липидов мембран

СВОЙСТВА ЛИПИДОВ МЕМБРАН

43. СВОЙСТВА ЛИПИДОВ МЕМБРАН

СОДЕРЖАНИЕ В РАЗНЫХ МЕМБРАНАХ ОТ 15 ДО 50%
АМФИФИЛЬНОСТЬ МОЛЕКУЛ ЛИПИДОВ
Гидрофильная головка
S=0,6 нм2
¼ длины всей молекулы
Гидрофобный хвост
S=0,2 – 0,3 нм2

44.

АМФИФИЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ
ОБЛАДАЮТ ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИМИ
СВОЙСТВАМИ
Ф. Рейнитцер
1857 - 1927
Жидкие кристаллы открыл в 1888 году австрийский ботаник Ф.
Рейнитцер. Он обнаружил, что при температуре ниже 145оС
холестерилбензоат был твердым кристаллом, при 178оС –
прозрачной жидкостью, а в диапазоне температур 145оС - 178оС –
мутной жидкостью.

45.

О.Леман при исследовании холестерилбензоата в
состоянии мутной жидкости в поляризованном свете
обнаружил у объекта анизотропию свойств - типичное
свойство кристаллов.
Отто Леман
1855 - 1922
По структуре ЖК представляют собой желеобразные
жидкости, состоящие из молекул вытянутой формы,
определённым образом упорядоченных во всем
объёме этой жидкости.
Увеличенное изображение жидкого
кристалла

46. ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ЛИПИДОВ В МЕМБРАНАХ

ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ ОБЛАДАЮТ АМФИФИЛЬНЫЕ
СОЕДИНЕНИЯ
ЖИДКИЙ КРИСТАЛЛ СОЧЕТАЕТ СВОЙСТВА КРИСТАЛЛА И ЖИДКОСТИ
СВОЙСТВА КРИСТАЛЛА
АНИЗОТРОПИЯ (ЗАВИСИМОСТЬ ФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ОТ НАПРАВЛЕНИЯ)
УПОРЯДОЧЕННОСТЬ
СВОЙСТВА ЖИДКОСТИ
ТЕКУЧЕСТЬ
СПОСОБНОСТЬ ОБРАЗОВЫВАТЬ КАПЛИ

47. РАСПОЛОЖЕНИЕ МОЛЕКУЛ В ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ

Нематическая: молекулы
ориентированы параллельно друг другу
Смектическая : молекулы образуют
слои (характерно для биомембран)
Холестерическая : молекулы
расположены параллельно друг
другу в одной плоскости, но в
разных плоскостях их ориентация
разная

48.

ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ
ЛИПИДОВ В МЕМБРАНАХ
По результатам рентгеноструктурного анализа кристаллов
дилауроилфосфатидилэтаноламина (ДЛФЭ) молекулы
фосфолипида располагаются в виде чередующихся
бимолекулярных слоев.