Секвенирование нового поколения (NGS)

1.

Секвенирование нового поколения (NGS)
Васильев Геннадий Владимирович
Институт цитологии и генетики СО РАН

2.

Революция цены в геномных исследованиях
454 GS20
1000 Геномов
SOLiD 3.0
Illumina GA2

3.

Второе поколение секвенаторов – NGS – создатели геномики
Roche FLX Titanium
SOLiD 5500
Illumina HiSeq
Ion Proton

4.

Принцип пиросеквенирования

5.

Пиросеквенирование: приготовление библиотек

6.

Пиросеквенирование: ПЦР в эмульсии

7.

Пиросеквенирование: секвенирование

8.

Пиросеквенирование: секвенирование

9.

Пиросеквенирование: анализ результатов
Особенности:
1) Лучшее качество и
высокая цена
2) Невозможность
разрешения политрактов
длиннее 5-7-9 осн.
3) Длинные фрагменты (600800 п.н.) без использования
mate-pair библиотек
4) Активно применялся для
секвенирования de novo и
метагеномов
Ресеквенирование генома S. cerevisiae - 12,070,820 (12 Mb) при 20х покрытии
Total Genomic Coverage 95.14%, Number of Contigs – 694, Average Contig Size 16.547 bases

10.

SOLiD
SOLiD 4
SOLiD 5500
Особенности:
1) Самые короткие чтения 50 или 75 п.н., используется при ресеквенировании и анализе
транскриптомов
2) Есть чтение mate-pair библиотек
3) Достаточно высокая точность при использовании специализированного ПО

11.

Шаг 1: Подготовка библиотек

12.

SOLiD: результат ПЦР в эмульсии
1.6 x 109
150 – 300 x 109

13.

E-PCR

14.

E-PCR
P1-coupled beads
1) Template Anneals to P1
2) Polymerase extends from P1
3) Complementary sequence is
extended off bead surface
4) Template disassociates

15.

Шаг 3: обогащение полученных бидсов
P2’
P1
P2 Large (5µ)
Polystyrene
P2
P1
bead
Centrifuge in
glycerol gradient
Supernatant
Captured beads with templates
Pellet
Beads with no template

16.

Шаг 4: 3′-модификация концов и нанесение бидсов
Beads attached to glass
surface in a random array

17.

SOLiD: Пробы
2 Base Pair Encoding
Using 4 Dyes
Red-probe
2nd Base
1st Base
A
C
G
5’
3’
n n n A T z z z
T
A
C
G
T
Blue-probe
3’
5’
n n n T T z z z
On our probes the 1st base encoded is
position 4
the 2nd base encoded is position 5

18.

SOLiD

19.

SOLiD
P1 Adapter
Internal Adapter
P2 Adapter
1µm
bead
25 base
Tag #1
25 base
Tag #2

20.

SOLiD read
ACGGTCGTCGTGTGCGT
SNP
1st Base
ACGGTCGTCGTGTGCGT
Insertion / Deletion
A
C
G
T
2nd Base
A C G T

21.

SOLiD: SNP и ошибки чтения
SNP
98% raw base accuracy
99,99% consensus accuracy (~ 20x coverage)
error
Reference
SNP 2 colors change

22.

Технология фирмы Illumina – HiSeq, MySeq, NextSeq, NovaSeq
Особенности:
1) Чтения 50-300 п.н. прямые либо парные
2) Есть чтение mate-pair библиотек
3) Доминирующая на рынке (80-90%), применяется везде.

23.

Illumina

24.

Illumina

25.

Illumina

26.

Illumina GA и HiSeq vs NovaSeq

27.

Illumina NextSeq и Nova Seq
Используются только два красителя и длины
волн

28.

Ion \ Proton Torrent
Особенности:
1) Не используется высокочувствительная оптика
2) Длинное чтение (до 400 п.н. непостоянной длины)
3) Самая быстрая скорость работы
4) Меньшая точность

29.

Ion \ Proton Torrent - E-PCR

30.

Ion \ Proton Torrent

31.

Ошибки и проблемы NGS
Связанные с пробоподготовкой
1) Искажения представленности
2) Химерные последовательности,
ошибки баркодирования
3) Фоновый шум

32.

Ошибки кластеризации и баркодирования, поликлональность

33.

Ошибки и проблемы NGS
Связанные с особенностями метода
1)Искажения представленности
2)Систематические ошибки
3)Химерные контиги, ошибки
анализа данных
4)Неверные алгоритмы анализа

34.

Ошибки и проблемы NGS – анализ Q-scores
+ искажения, вносимые
анализом

35.

Мировая карта NGS систем

36.

Спасибо за внимание