Определение антибиотико-чувствительности микроорганизмов

1. Определение антибиотико-чувствительности микроорганизмов

Определение антибиотикочувствительности
микроорганизмов

2. Определение антибиотикочувствительности микроорганизмов

методы
Дискодиффузионный
метод
Е-тест
Метод серийных
разведений
В жидкой
питательной
среде
В плотной
питательной
среде

3. Диско-диффузионный метод

Питательные среды:
• АГВ
• Среда Мюллера Хинтона
Для микроорганизмов со сложными питательными
потребностями в среду вносят ростовые добавки:
кровь,
сыворотка крови.
Добавление глюкозы недопустимо.

4. Диско-диффузионный метод

Приготовление чашек
Чашки подсушивают,
на дне чашки
отмечают места
наложения дисков

5. Диско-диффузионный метод

Приготовление инокулята
Инокулят готовят из
чистой 18-20-часовой
культуры бактерий,
выросшей на
поверхности плотной
питательной среды

6. Диско-диффузионный метод

Приготовление инокулята
Исследуемую
культуру
смывают
стерильным
изотоническим
раствором
хлорида натрия

7. Диско-диффузионный метод

Приготовление инокулята
Суспензию разводят
стерильным
изотоническим раствором
хлорида натрия
до мутности оптического
стандарта
ГИСК им. Л. А. Тарасевича
на 10 ед.

8. Диско-диффузионный метод

Нанесение суспензии на поверхность
агаровой среды
Инокулят в объеме
1 мл наносят на
поверхность
агаровой среды

9. Диско-диффузионный метод

Нанесение суспензии на поверхность
агаровой среды
Инокулят равномерно
распределяют по
поверхности шпателем
или путем
покачивания чашки

10. Диско-диффузионный метод

Нанесение суспензии на поверхность
агаровой среды
Чашку наклоняют
и дают остатку
суспензии стечь
на одну сторону

11. Диско-диффузионный метод

Нанесение суспензии на поверхность
агаровой среды
Избыток суспензии
удаляют пастеровской
пипеткой. Чашки
выдерживают при
комнатной температуре
10-15 мин. для полного
впитывания суспензии.
Перед наложением
дисков поверхность
среды должна быть
сухой.

12. Диско-диффузионный метод

Наложение дисков
Перед использованием флаконы
с дисками необходимо выдержать
при комнатной температуре
в течение 1 часа для
предотвращения образования
конденсата на внутренней
стенке флакона.
Диски с помощью пинцета
накладывают на поверхность
агара на одинаковом
расстоянии один от другого
и примерно на расстоянии
2 см от края чашки.
На одну чашку следует
помещать не более 6 дисков.

13. Диско-диффузионный метод

Инкубация чашек
Чашки ставят в термостат сразу после
наложения дисков и инкубируют в
течение 18-20 часов при 37 ºС,
перевернутыми кверху дном.

14. Диско-диффузионный метод

Учет результатов
Чашки помещают
кверху дном на
темную матовую
поверхность так,
чтобы свет падал под
углом 45º (учет в
отраженном свете).

15. Диско-диффузионный метод

Учет результатов
С помощью
линейки или
измерителя
измеряют диаметр
зон задержки
роста вокруг
дисков, включая
диаметр самих
дисков, с
точностью до 1
мм.

16. Диско-диффузионный метод

Учет результатов
При не резко
очерченном крае
зоны или зоне с
двойным контуром
следует измерить
диаметр зоны по
наиболее четкому
контуру

17. Диско-диффузионный метод

Интерпретация полученных результатов
Пример:
Гентамицин – зона задержки роста 13 мм;
Левомицетин – зона задержки роста 17 мм;
Ципрофлоксацин – зона задержки роста 23 мм.
Антибиотик
Диаметр зон для культур
устойчивых промежу- чувствиточных
тельных
Гентамицин
≤ 15
-
≥ 16
Левомицетин
≤ 15
16-18
≥ 19
Ципрофлоксацин
≤ 15
16-20
≥ 21

18. Диско-диффузионный метод

Контроль воспроизводимости
и точности полученных результатов
Для контроля воспроизводимости и точности процедуры
определения чувствительности необходимо при
каждой постановке теста параллельно с испытуемыми
штаммами использовать эталонные штаммы E. coli,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Диаметры зон задержки роста эталонных штаммов
должны соответствовать табличным значениями.
Эталонные штаммы могут быть использованы для
проверки качества среды, дисков и правильности
методики постановки теста.

19. Приготовление раствора антибиотика

Основной раствор
Рабочий раствор
(готовится на
растворителе)
1000 мкг (ЕД) в 1 мл
1 мл
1 мл
1:100
1:1000
1 мл
1:10
Основной
раствор
1000
мкг/мл
(готовится на
питательной среде)
100
мкг/мл
10
мкг/мл
1
мкг/мл
Первая пробирка ряда

20. Серийное разведение антибиотика

100 мкг/мл
2мл
2мл
2мл
2мл
2мл
2мл
2мл
2мл
2мл
2мл
2мл
2мл
0,7
1,5
3
6
12
25
50
2 мл
2мл
0,07
2 мл
2мл
0,007
0,15
2мл
0,015
0,3
2мл
0,03
0,6
2мл
0,06
1,2
0,12
0,5
2мл
0,25
2мл
2мл
1 мкг/мл
2,5
5
10 мкг/мл
2мл
2 мл

21. Подготовка суспензии микроорганизмов

Суспензия с концентрацией
микроорганизмов
109 (10 ЕД оптического
стандарта мутности)
18-20 часовая
чистая культура
исследуемого
микроорганизма
0,1 мл
Разведение
1:100
107
Разведение
1:1000
106
1 мл
10 мл
МПБ
9 мл
МПБ

22. Внесение суспензии в пробирки с разведениями

106
в 1 мл – 1000 000 микроб. клеток
в 0,1 мл – 100 000 микроб. клеток
Контроль чистоты
культуры
по 0,2 мл
контроль

23. Учет результата

10
мкг/мл
5
мкг/мл
2,5
мкг/мл
Нет роста
1,2
мкг/мл
0,6
мкг/мл
МПК
0,3
мкг/мл
0,15
мкг/мл
0,07
мкг/мл
Рост
микроорганизмов

24. Е-тест

Зона роста
культуры
Эллипсовидная зона
подавления
роста
МПК
2 мкг/мл

25. Е-тест