Применение лазерных технологий («лазерный пинцет») для исследования динамики наномашин

1.

Применение лазерных технологий
(«лазерный пинцет») для
исследования динамики наномашин

2. Биологические наномашины существуют миллионы лет

3. «Лазерный пинцет» – инструмент для работы с нанообъектами

лазер, λ=1064 нм
наночастица
F = k·x

4.

• Опти́ческий пинце́т (англ. Optical tweezers), иногда
«лазерный пинцет» или «оптическая ловушка» —
научный прибор, который позволяет манипулировать
микроскопическими объектами с помощью лазерного
света. Он позволяет прикладывать к
диэлектрическим объектам силы от фемтоньютонов
до наноньютонов и измерять расстояния от
нескольких нанометров до микронов.
• В последние годы оптические пинцеты начали
использовать в биофизике для изучения структуры и
принципа работы белков.

5. Схема использования оптического пинцета в изучении РНК-полимеразы

6. Физические принципы

• Объекты, представляемые в виде маленьких
диэлектрических сфер взаимодействуют с
электрическим полем, созданным световой волной,
за счёт индуцированного на сфере дипольного
момента. В результате взаимодействия этого диполя
с электрическим полем электромагнитной волны,
объект перемещается вдоль градиента
электрического поля. Кроме градиентной силы, на
объект также действует сила, вызванная давлением
(отражением) света от его поверхности. Эта сила
толкает сферу по направлению пучка света. Однако,
если луч света сильно сфокусирован, величина
градиента интенсивности может быть больше
величины давления света.

7. Волновая оптика

Объяснение на основе волновой оптики. Когда шар смещается от
центра пучка, как на рисунке (a), наибольшее изменение импульса
лучей с большей интенсивностью вызывает появление силы,
направленной к центру ловушки. Когда шар расположен в центре
пучка, как показано на рисунке (b), сила указывает в сторону сужения.
При анализе с использованием волновой оптики, рассмотрение
процессов преломления и отражения света от микросферы достаточно,
чтобы проанализировать втягивание в оптическую ловушку (см.
рисунок справа).
Самый простой расчёт действующих сил в пределах подхода волновой
оптики основывается на геометрической оптике. Рассмотрение луча
указывает на изменение импульса света при отражении и
преломлении. Таким образом, это изменение импульса (фотона как
частицы), согласно второму закону Ньютона, будет приводить к
возникновению силы.
Используя простую диаграмму лучей и вектора силы, можно показать,
что на микросферу действуют две разных оптических силы благодаря
инерции падающего и преломлённого света. Как это видно из
диаграммы, результирующая сила толкает сферу в направлении
области наивысшей интенсивности луча. Такая сила называется
градиентной силой.

8.

Когда шар смещается от центра
пучка, как на рисунке (a),
наибольшее изменение
импульса лучей с большей
интенсивностью вызывает
появление силы, направленной к
центру ловушки. Когда шар
расположен в центре пучка, как
показано на рисунке (b), сила
указывает в сторону сужения.

9.

• Соответствующая сила действующая на
частицу (латексная сфера диаметром 0,51;
1,31 и 2,68 микрона) в воде получается из
закона Стокса
• F = 6πrηv
• и составляет 730 фН.
• В воздухе максимальная скорость для капель
воды диаметром 5 микрон при мощности
лазера 50 мВт составила 0,25 см/c

10.

• Чтобы исследуемый объект был неподвижен,
необходимо скомпенсировать силу
вызванную давлением света. Это можно
сделать за счёт двух встречных пучков света,
которые толкают сферу в противоположных
направлениях, или с помощью сильно
сфокусированного гауссового пучка (с
высокой числовой апертурой, NA>1,0), чтобы
компенсировать давление света высокой
градиентной силой.

11. Приближение электрического диполя

• В случаях, когда диаметр пойманной в
ловушку частицы значительно меньше,
чем длина волны света, условия
удовлетворяют условию рассеивания
Рэлея, и частицу можно рассмотреть
как точечный диполь в неоднородном
электромагнитном поле. Сила,
действующая на заряжённую частицу в
электромагнитной области, известна как
dx
сила Лоренца
F q E
B
dt

12.

Предполагая, что мощность лазера не зависит от времени, сила запишется в
виде
1
F E 2
2
Квадрат величины электрического поля равен интенсивности луча как функция
координат. Поэтому, результат указывает, что сила действующая на
диэлектрическую частицу, при приближении точечного диполя, является
пропорциональной градиенту интенсивности пучка. Другими словами,
описанная здесь сила приводит к притяжению частицы в область с самой
высокой интенсивностью. В действительности, сила, возникающая при
рассеянии света зависит линейно от интенсивности луча, поперечного сечения
частицы и показателя преломления среды, в которой находится ловушка
(например, вода), работает против градиентной силы в осевом направлении
ловушки, приводя к тому, что равновесное положение смещается немного вниз
от положения максимума интенсивности.

13. Оптические пинцеты в сортировке клеток

14.

Одна из наиболее распространённых систем сортировки клеток использует
метод флуоресцентной проточной цитометрии. В этом методе суспензия
биологических клеток сортируется в несколько контейнеров согласно
флюоресцентным характеристиках каждой клетки в потоке. Процесс сортировки
контролируется электростатической системой отклонения, которая направляет
клетку к определённому контейнеру изменением напряжения приложенного
электрического поля.
В оптически управляемой системе сортировки, клетки пропускают через двухили трёхмерные оптические решётки. Без индуцируемого электрического
напряжения, клетки сортируются по их свойствах преломления света.
Разработана методика использования дифракционной оптики и других
оптических элементов для создания таких оптических решёток.
Главный механизм сортировки — расположение узлов оптической решётки.
Когда поток клеток проходит через оптические решётки, силы трения частиц
непосредственно конкурируют с оптической градиентной силой от соседнего
узла оптической решётки. Изменяя расположение узлов, возможно создать
оптическую дорожку, по который будут двигаться клетки. Но такая дорожка
будет эффективной только для клеток с определённым коэффициентом
преломления, которые и будут эффективно отклоняться. Регулируя скорость
потока клеток и мощность света возможно получить хорошую оптическую
сортировку клеток.

15. Характеристики «лазерного пинцета»

Предельное пространственное
разрешение
0.1 нм
Диапазон измерения сил
0.01 – 200 пН
Количество одновременно
работающих ловушек
1 - 100
Размер перемещаемых частиц
20 – 10000 нм
Диапазон перемещений
100 мкм

16. Наномашины, участвующие в делении клетки

Измеренная сила
5 пН
Перемещение с шагом 8 нм
Grishchuk E.L. et al., Force production
by disassembling microtubules.
Nature, 2005, v. 438(7066), p. 384-8

17.

• Microtubules (MTs) are important components of the eukaryotic
cytoskeleton: they contribute to cell shape and movement, as well
as to the motions of organelles including mitotic chromosomes. MTs
bind motor enzymes that drive many such movements, but MT
dynamics can also contribute to organelle motility1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8.
• Each MT polymer is a store of chemical energy that can be used to
do mechanical work, but how this energy is converted to motility
remains unknown. Here we show, by conjugating glass microbeads
to tubulin polymers through strong inert linkages, such as biotin–
avidin, that depolymerizing MTs exert a brief tug on the beads, as
measured with laser tweezers.
• Analysis of these interactions with a molecular-mechanical model of
MT structure and force production9, 10 shows that a single
depolymerizing MT can generate about ten times the force that is
developed by a motor enzyme; thus, this mechanism might be the
primary driving force for chromosome motion. Because even the
simple coupler used here slows MT disassembly, physiological
couplers may modulate MT dynamics in vivo.

18. Принцип измерения положения с субнанометровой точностью

нанообъект
фотодетектор из 4-х
квадрантов
увеличение изображения
дифракционной картины
нанообъекта в лазерном
луче
компьютерный
сбор данных и
обработка

19. Пример. Работа по измерению шагов, делаемых РНК полимеразой. 1 измеренный шаг – 0.34 нм

Схема эксперимента по
измерению движения одной
молекулы РНК полимеразы
вдоль ДНК.
На графике отчетливо видно как молекула РНК
двигается делая шаги в 3.4 А, которые
измеряют лазерным пинцетом. Один шаг
соответствует длине одной пары нуклеиновых
оснований
(Abbondanzieri et al., .2004. Nature. 438(7067):460-465)

20. Схема установки

Пьезо-столик
Регистрирующий
лазер 780 нм, 100мВт
Лазер ловушка
10Вт, 1064 нм.
Акусто-Оптические
дефлекторы
Регистрирующий
лазер 830 нм, 100мВт
Лазер 633 нм, 10 мВт для настройки и
второй путь лазерной ловушки
микроскоп ZEISS AxioImagerПЗС камера
Схема установки
Система регистрации.
Фотодетекторы.
Лазеры для микрохирургических
операций в клетке
488 нм и 532 нм, 100мВт каждый