Секвенирование по Сэнгеру

1. Секвенирование по Сэнгеру

Дарья Токер
ИФиТМ (ББ), 3 курс, группа 0901
СНК по медицинской генетике
Первого МГМУ им. И.М. Сеченова
Научный руководитель: Литвинова М.М.
к.м.н., врач-генетик, доцент кафедры медицинской генетики

2. Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик

Розалинда Франклин
1953 - Структура молекулы ДНК
Источник: http://www.achievement.org/achiever/james-d-watson/ https://profiles.nlm.nih.gov/ps/retrieve/ResourceMetadata/KRBBJW
Photo 51 taken by Rosalind Franklin and RG Gosling. (https://www.theguardian.com/ )

3. Фредерик Сэнгер Дважды Нобелевский лауреат: 1958 – Установление структуры молекулы инсулина 1980 – Метод секвенирования ДНК

Рэй Ву
Фредерик Сэнгер
1970 – Метод расширения
праймеров для определения
последовательности ДНК
Дважды Нобелевский лауреат:
1958 – Установление структуры молекулы
инсулина
1980 – Метод секвенирования ДНК
Image credit: https://www.britannica.com/biography/Frederick-Sanger, http://www.sciencedirect.com/

4. Два метода Сэнгера

«Плюс-минус» метод (1975)
Метод секвенирования по
Сэнгеру (1977)
• Другие названия:
–метод терминаторов
–метод дидиоксинуклеотидов
–дидиоксисеквенирование
(Sanger dideoxy sequencing)
–метод обрыва цепи (the
chain termination method)
Геном фага φX174, состоящий из 5,386 bp.
Каждый цветной блок обозначает
отдельный ген.
Источник: https://en.wikipedia.org/

5.

Секвенирование ДНК процесс определения
нуклеотидной последовательности
(A, T, C, G) фрагмента цепи ДНК

6. Метод ди-диоксинуклеотидов

Метод Сэнгера, или
дидиоксисеквенирование
основано на модифицированной
форме полимеразной цепной
реакции – синтезе множества
копий всех возможных длин
изучаемой цепи ДНК in vitro с
остановкой синтеза на заданном
нуклеотиде путем присоединения
специального видоизмененного
нуклеотида и последующем
считыванием последовательности
по флуоресцентно (или
радиоактивно) меченным
нуклеотидам, находящимся на
конце каждого отрезка неполной
копии цепи.
1)
Клонирование ДНК (ПЦР)
2)
Начало репликации,
терминация цепи, образование
набора олигонуклеотидных
последовательностей
3)
Разделение молекул по длине
Гель-электрофорез
Капиллярный электрофорез
4)
Обработка и анализ
результатов
Радиоавтограф
Автоматический секвенатор

7. Метод ди-диоксинуклеотидов Подготовка реакции

Источник: "Whole-genome sequencing: Figure 1," by OpenStax College, Biology (CC BY 4.0),

8. Репликация ДНК

Источник: https://en.wikipedia.org/

9. Синтез цепи. Присоединение диоксинуклеотида

Диоксинуклеотидтрифосфат =
азотистое основание +
сахарофосфатный остов
Источник: Left panel, "Whole-genome sequencing: Figure 1," by OpenStax College, Biology (CC BY
4.0), Right panel, “Discovery of the structure of DNA” by Khan Academy

10. Обрыв цепи. Присоединение дидиоксинуклеотида

Источник: Left panel, "Whole-genome sequencing: Figure 1," by OpenStax College, Biology (CC BY
4.0), Right panel, “Discovery of the structure of DNA” by Khan Academy

11. Результаты реакции обрыва цепи

TGAGTCTACGA
TGAGTCTACGA
TGAGTCTACGA
Reading
Electrophoresis
Изображения изменены, источник: https://binf.snipcademy.com/ «Sanger sequencing»
TGAGTCTACGA
T
G
A
G
T
C
T
A
C
G
A

12. Принципиальная схема реакции

Гель-электрофорез: разделение молекул
ДНК по длине
Источник: https://www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/

13. Гель-электрофорез: разделение молекул ДНК по длине

Электрофорез. Результаты
Ex.1
Ex.2
Ex.3
Ex.4a
Ex.4b
Ex.4c
Ex.4d
600 bp
Результаты электрофореза полученных ампликонов разные экзоны гена HJV

14.

Reading
Электрофорез. Результаты
Изображение изменено, источник: https://binf.snipcademy.com/ «Sanger sequencing»

15.

Как визуализировать фрагменты ДНК?
– Меченные праймеры (радиоактивные изотопы 32Р)
– Меченные dNTPs (32Р)
• Флуоресценция
– Бромистый этидий
– ddNTPs, меченные флуорофорами
Источник: https://slideplayer.com
• Радиоактивность

16. Как визуализировать фрагменты ДНК?

Прошлое и настоящее
Сравнение электрофореграммы (с использованием радиоактивных
изотопов) с флуоресцетной хроматограммой
До начала 1990-х
Источник: https://blogs.scientificamerican.com/ ; https://slideshare.net/
Настоящее время

17. Прошлое и настоящее Сравнение электрофореграммы (с использованием радиоактивных изотопов) с флуоресцетной хроматограммой

Капиллярный электрофорез
Image modified from "Sanger sequencing," by Estevezj (CC BY-SA 3.0). The modified image is licensed under a (CC BY-SA 3.0) license.

18. Капиллярный электрофорез

Результаты автоматического секвенирования
Референсный геном
Сравнение в автоматическом режиме
Результат сиквенса
G320V
G320V
гетерозигота
гомозигота
(K означает G или T)
Вид сиквенса при различных генотипах по мутации G320V гена HJV
wt – “wild type”

19.

Автоматический секвенатор
В настоящее время
10 лет назад

20.

Сравнение с другими методами
Плюсы
Минусы
• Длина рида 300-1000 пн.
Для сравнения у
пиросеквенирования
(NGS) этот параметр не
превышает 150
нуклеотидов
• Высокая точность
(≥ 99.999%)
• Высокая стоимость (сотни
долларов за Mbp)
• Особо "трудные" участки
(тандемные повторы,
псевдогены)
• Нельзя обнаружить крупные
транслокации, делеции
• Необходимость клонировать
каждый фрагмент

21. Сравнение с другими методами

Использование метода
• Секвенирование отдельных генов
• Подтверждение результатов, полученных методами
секвенирования следующего поколения (для
клинических целей)
• Секвенирование очень маленьких геномов (вирусные
или бактериальные)
• Впервые секвенирован геном человека - The Human
Genome Project