Жидкостная хроматография

1. Жидкостная хроматография

Ионообменная, ионная хроматография
В основе методов лежит процесс замещения ионов,
связанных с неподвижной фазой, ионами элюента,
поступающими в колонку.
Процессы динамического ионного обмена основаны на
общих принципах элюативной хроматографии.
Вещества,
способные
к
обмену
ионообменниками или ионитами
ионами,
называют
В зависимости от знака заряда обмениваемых ионов
различают катиониты и аниониты
Определение
отдельных
элементов
соответствующих
фракциях
элюата
химическими методами.
проводят
в
классическими
1

2.

В качестве ионитов обычно используют синтетические
полимерные вещества на основе сополимера стирола
и дивинилбензола СТ-ДВБ,
называемые ионообменными смолами.
Ионообменные смолы состоят из матрицы R и
активных групп, содержащих подвижные ионы:
R-SO3-H, R-OH, R-PO3H2, R-COO – катиониты;
R-NH2, R-NH, R-N(CH3)3, R-NH3OH – аниониты.
В
катионои
анионообменниках
следующие реакции
R-H + Na+ = R-Na + H+
R-OH + Cl- = R-Cl + OH-
протекают
2

3.

Твердость и механическая прочность сополимера
зависит от степени сшивки, т.е. от процентного
содержания дивинилбензола.
Смолы с высокой степенью сшивки (8-30% ДВ),
способны
не
изменять
объем
в
различных
растворителях, выдерживать большие давления без
сжатия (усадки), пригодны для хроматографирования
малых ионов.
Смолы с низкой степенью сшивки 2-4% применяют
для хроматографирования макромолекул.
3

4.

Ионообменники, содержащие сильнокислотные
или сильноосновные группы, реагирующие с
любыми
ионами
раствора,
называются
универсальными.
Ионная
хроматография
– высокоэффективный
вариант ионообменной хроматографии.
Ионообменные материалы, необходимые для
работы в условиях ВЭЖХ должны обладать
достаточной
механической
прочностью,
набухаемостью и скоростью диффузии в поры
частиц сорбента.
4

5.

В ионной хроматографии взамен классических
ионообменных смол разработаны специальные
наполнители колонок:
1. сферические частицы d=30-40 мкм
непористого
стекла
или
высокопрочного
полимера, покрытые тонким слоем пористого
ионообменника;
2. частицы пористого силикагеля, покрытые
слоем жидкого ионообменника.
5

6.

Каждый
ионит
характеризуется
обменной
емкостью и степенью набухания.
Обменная емкость - количество эквивалентов
ионов, обмениваемых 1 г ионита.
Степень набухания – объем упакованного в
колонну обменника (в мл), приходящийся на 1 г
его в сухом виде, мл/г.
Емкость различных смол колеблется от 0,5 до 10
ммоль·экв/г.
Для обозначения сильных ионообменников
применяют символ S, а для слабых - W .
6

7.

Для оценки селективности ионообменников
применяют экспериментально установленные
ряды сродства:
для катионообменников:
Li+ < Na+ < K+< Rb+ <Cs+< Mg2+ < Ca2+<Sr2+< Ba2+
для анионообменников:
F- < OH- <Cl- < Br- < NO3- < SCN- < ClO4-
7

8.

Элюирующая сила подвижной фазы в ионной
хроматографии зависит от
рН, ионной силы,
природы применяемого буферного раствора,
присутствия органического растворителя или ПАВ.
При выборе значения рН учитывают природу
ионогенных групп разделяемых ионов, природу
матрицы.
Поддерживают значение рН:
рН 2 – 12 для сильнокислотных
сильноосновных ионообменников;
рН
5 -12
для слабокислых;
рН
2–6
для слабоосновных.
или
8

9.

При разделении слабых кислот
рН = рКа + 1,5;
При разделении слабых оснований
рН = рКв-1,5.
Ионная сила влияет на емкость ионита,
с увеличением I - сорбция ионов уменьшается и
возрастает элюирующая сила растворителя.
9

10.

Для ускорения и улучшения разделения ионов
применяют
градиентное
элюирование
–
последовательно применяют буферные растворы с
увеличивающейся ионной силой.
В качестве элюентов наиболее часто используют
воду,
ацетатный,
боратный,
фосфатный,
гидрокарбонатный буферные растворы,
а также растворы органических и неорганических
кислот с определенным значением рН.
10

11.

Ионообменное равновесие описывают
константой обмена.
Для равновесия
RKt + M+ = RM + Kt+
K = (aRMaKt)/(aRKtaM).
При замене активностей концентрациями
получают концентрационную константу,
называемую коэффициентом селективности.
Если концентрация одного из ионов в растворе и
в фазе ионита велика по сравнению с другими,
например, [Kt]>>[M] и [RKt] >> [RM],используют
коэффициент распределения D=[RM]/[M].
11

12.

Существуют два варианта ионной хроматографии.
Двухколоночная ионная хроматография
В ионной хромтатографии в качестве универсального
метода
детектирования
используется
кондуктометрический.
Сам элюент представляет раствор электролита
высокой концентрации и обладает собственной
электропроводностью,
детектирование
путем
простого измерения электропроводности элюата
невозможно.
Проблемы детектирования решены
за счет
использования подавляющей колонки и специального
выбора подвижной фазы. Подавляющая колонка
располагается за разделяющей.
12

13.

Принцип действия подавляющей колонки на
примере определения анионов. Подавляющая
колонка заполняется катионообменником в Н+ форме. Подвижная фаза может представлять
раствор
NaHCO3/Na2CO3.
Компоненты
подвижной фазы, выходящие из разделяющей
колонки,
реагируют
с
катионообменником
подавляющей колонки:
Na++ HCO + H = Na + H2CO3
3
2Na++
CO2 + 2H =2 Na + H2CO3
3
Черта означает
ионообменника.
нахождение
иона
в
фазе
13

14.

Таким образом, собственные ионы подвижной
фазы в результате ионного обмена превращаются в
малодиссоциированную и обладающую очень малой
электропроводностью
угольную
Определяемые ионы, например, Cl- или
претерпевают
химических
на
подавляющей
превращений
и
колонке
сохраняют
кислоту.
NO3
не
никаких
свою
электропроводность.
Подавители
электропроводности
элюента
выполняют также в виде мембран и полых волокон.
14

15.

Этот
вариант
имеет
более
высокую
чувствительность определения (больше, чем на
порядок).
Но обладает рядом недостатков:
увеличение
экстраколоночных
эффектов,
требование дополнительного
аппаратурного
оформления,
необходимость
периодической
регенерации и наличия больших мертвых
объемов.
Применение: контроль качества воды, анализ
качества
пара
при
контроле
воды
электростанций; в ядерной энергетике контроль
радиоактивных выбросов.
15

16.

Одноколоночная ионная хроматография
Если собственная электропроводность подвижной
фазы достаточно мала, то можно обойтись и без
подавляющей колонки.
Элюентами с малой электропроводностью служат
растворы слабых органических кислот, например,
фталевой, бензойной, или салициловой.
Для обеспечения постоянства электропроводности
и ионной силы элюента следует очень точно
поддерживать значение рН раствора.
Необходимость
отсутствует,
если
детектирование.
в
подавляющей
колонке
используют
фотометрическое
16

17.

Ион-парная хроматография – жидкостная
хроматография, в которой подвижная фаза
содержит сорбируемое ионогенное вещество
(ион-парный реагент) и разделение смеси
веществ происходит за счет различия в
способности веществ к образованию ионных пар
и (или) в коэффициентах распределения ионных
пар между подвижной и неподвижной фазами.
Суть
метода:
в
динамическом
модифицировании обращено-фазового сорбента
группами,
обладающими
ионообменными
свойствами.
Для этих целей в типичные ПФ
для ОФХ
добавляют
гидрофобные
органические
соединения с ионогенными группами.
17

18.

Для
разделения
оснований
используют
алкилсульфаты натрия (алкил от С4 до С12) в
количестве 0,001-0,01 моль/л, создавая буфером
рН 2-5.
Для разделения кислот применяют соли
тетраалкиламмония (фосфат тетрабутиламмония,
бромид
цетилтриметиламмония
и
др.)
в
концентрациях 0,001-0,01 моль/л и рН 3-7.
В
ионпарном
режиме
селективность
разделения неионогенных компонентов будет
лимитироваться обращено-фазовым механизмом
удерживания, а удерживание оснований и кислот
заметно возрастет, улучшится форма пиков
18

19.

Эксклюзионная хроматография
Разделение происходит за счет распределения
молекул между растворителем, находящимся
внутри
пор
сорбента,
и
растворителем,
протекающим
между
его
частицами,
т.е.
различное удерживание
веществ обусловлено
различиями в размерах молекул, их форме и
способности проникать в поры неподвижной
фазы.
Гель-проникающая
хроматография
эксклюзионная
хроматография,
неподвижной фазой служит гель.
в
(ГПХ)
которой
19

20.

Роль
твердого
наполнителя
состоит
формировании пор определенного размера,
а неподвижной фазой является
заполняющий эти поры.
в
растворитель,
Особенность метода – возможность разделения
молекул по их размеру в растворе в диапазоне
молекулярных масс 102 - 108, что делает его
незаменимым для исследования синтетических
высокомолекулярных веществ и биополимеров.
20

21.

Объем эксклюзионной колонки:
Vc=VM+Vi+Vd,
где VM - мертвый объем (объем растворителя
между частицами сорбента, т.е. объем подвижной
фазы);
Vi - объем пор, занятый растворителем (объем
неподвижной фазы);
Vd - объем матрицы сорбента без учета пор.
Полный объем растворителя в колонке Vt
представляет собой сумму объемов подвижной и
неподвижной фаз:
Vt= VM+Vi.
21

22.

Связь
между
удерживаемым объемом
и молекулярной массой
(или размером молекул)
образца
описывается
калибровочной кривой.
Каждый
конкретный
сорбент характеризуется
своей
калибровочной
кривой,
по
которой
оценивают
область
разделяемых
на
нем
молекулярных масс.
22

23.

Точка А соответствует пределу эксклюзии,
или мертвому объему колонки VM .
Точка В отражает предел проникания. Все
молекулы, масса которых меньше, чем в точке В,
будут выходить одним пиком с удерживаемым
объемом Vt .
Между А и В располагается диапазон
селективного разделения.
С1 - отрезок, отсекаемый на оси ординат
продолжением отрезка CD;
С2 - тангенс угла наклона этого отрезка к оси
ординат.
С2 называют разделительной емкостью
колонки: число мл растворителя на один порядок
изменения молекулярной массы.
23

24.

Чем больше С2, тем селективнее разделение в
данном диапазоне масс.
В нелинейных областях (участки АС и ВД) с
уменьшением С2 эффективность
фракционирования снижается.
Изменением параметров взаимодействия в
системе полимер-сорбент-растворитель можно
переходить от адсорбционного механизма к
эксклюзионному и наоборот.
В общем случае
стремятся подавить
адсорбционные и другие побочные эффекты, так
как они существенно искажают результаты,
особенно при исследовании молекулярномассового распределения (ММР) полимеров.
24

25.

Отличие
Требования:
ЭХ
–
априори
известная
продолжительностиь
анализа,
возможность
предсказания порядка элюирования компонентов
по размеру их молекул, примерно одинаковая
ширина пиков и уверенность в выходе всех
компонентов пробы за короткий промежуток
времени, соответствующий Vt.
стабильность потока подвижной
фазы, температуры.
Ошибка определения средних молекулярных
масс при изменении температуры
на 100С
составляет
±10%.
Термостатирование
обязательно .
25

26.

Детектор: дифференциальный рефрактометр.
Растворитель должен удовлетворять требованиям:
1). Полностью растворять образец при температуре
разделения;
2). Смачивать поверхность сорбента и не ухудшать
эффективность колонки;
3). Предотвращать адсорбцию разделяемых веществ
с поверхностью сорбента;
4). Обеспечивать максимальную высокую
чувствительность детектирования;
5). Иметь низкую вязкость и токсичность.
26

27.

Наилучшим растворителем по комплексу свойств для
ЭХ синтетических полимеров является
тетрагидрофуран.
Анализируемое вещество
Растворитель
высокополярные и нерастворимые
в ТГФ полимеры (полиамиды,
полиакрилонитрил,
полиэтилентерефталат,
полиуретаны и др.)
полимеры низкой полярности
(каучуки, полисоксаны)
Метилформамид,
м-крезол.
полиолефины
о-дихлорбензол,
1,2,3-трихлорбензол
Толуол, хлороформ
27

28.

Сорбенты:
Первоначально
на
основе
данных
о
химическом
составе
или
растворимости
анализируемых веществ устанавливают, какой
вариант
процесса
следует
применить
–
хроматографию в водных системах или в
органических растворителях, что в значительной
степени определяет тип сорбента.
Затем по калибровочной кривой выбирают
сорбент нужной пористости с учетом имеющихся
сведений о молекулярной массе образца.
Для
разделения
белков,
ферментов,
полисахаридов, полиэлектролитов используют
декстрановые
полиакриамидные,
гели, гели агарозы
гели
(сефадексы),
оксиакрилметакрилатные
28

29.

Стиролдивинилбензольные гели совместимы с
µ-стирогель (от1000Á и выше) пригоден для
элюентами умеренной полярности.
работы с тетрагидрофураном, ароматическими и
хлорированными углеводородами, гексаном,
циклогексаном, диоксаном, трифтолэтанолом,
гексафторпропанолом, диметилформамидом.
Эффективно – использование отдельных наборов
колонок для каждого растворителя.
29

30.

Если смесь содержит вещества, отличающиеся
по молекулярной массе не более чем на 2-2,5
порядка, то удается их разделить на колонках с
одним диаметром пор.
Иначе используют наборы из нескольких
колонок с сорбентами различной пористости.
Калибровочную кривую получают сложением
кривых для отдельных сорбентов.
30

31.

Принципиальная
черта
ЭХ
высокомолекулярных синтетических полимеров
заключается в невозможности разделения смеси
на индивидуальные соединения.
Эти
вещества
представляют
смесь
полимергомологов с разными молекулярными
массами Мi.
Молекулярную массу таких смесей оценивают
средней величиной, которая зависит от способа
усреднения.
31

32.

Мn получают методами криоскопии, осмометриии, эбуллиоскопии;
И wсреднемассовую
М
- с помощью светорассеивания
молекулярную массу:
и ультрацентрофугирования.
Ni – число молекул с массой Мi;
Различают среднечисленную молекулярную массу:
M
N
i i
Mn 1
( f /M ) N
i
i i
и среднемассовую молекулярную массу:
2
M
i Ni
M w f M
i i M N
i i
32

33.

Мn получают методами криоскопии,
осмометриии, эбуллиоскопии;
Мw - с помощью светорассеивания и
ультрацентрофугирования.
Ni – число молекул с массой Мi;
Mi N i
- общая масса полимера;
f M N / M N
i
i i
i i
- характеризует
Mw / Mn
полидисперсность полимера.
33

34.

Применение
ЭХ:
исследование
ММР
полимеров
и
анализа
макромолекул
биологического
происхождения
(белки,
нуклеиновые кислоты и т.д.).
Микропрепаративное
эксклюзионное
разделение часто используют в качестве первого
этапа при разделении сложных смесей путем
комбинации различных видов ВЭЖХ.
34

35.

35

36.

36

37.

37

38.

38

39.

39

40.

40

41.

41

42.

42

43.

43

44.

44