Функции и разнообразие РНК. Транскрипция

1. Функции и разнообразие РНК Транскрипция

2. Все типы РНК образуются в результате реакции матричного синтеза, в большинстве случаев матрицей служит одна из цепей ДНК.

Синтез РНК на
матрице ДНК – этот процесс называется транскрипцией, в котором участвуют
фермент РНК-полимеразы (транскриптазы).
1.Информационная/матричная РНК – содержит от нескольких 100-1000 нуклеотидов.
Представляет незамкнутую цепочку, переносит информацию о структуре белка с
ДНК на рибосому.
2.Гетерогенная ядерная РНК (гя-РНК) – является предшественником и-РНК
превращается в и –РНК в результате процессинга. Обычно гя-РНК длинее чем иРНК.
3.Рибосомальная РНК – входит в состав рибосом и выполняет структурную функцию,
принимает участие в синтезе полипептидной цепочки, составляет 85% всей РНК.
Клетки прокариот содержат 3 вида р-РНК, а эукариот - 4 вида.
4.Транспортная РНК – переносит аминокислоты к месту синтеза белков на рибосомы,
каждая молекула т-РНК содержит 80 нуклеотидов. Ее специфичность
определяется структурой антикодона – это участок соединения с конкретным
триплетом и-РНК.
5. Малые РНК. Кодируются в ядре, но работают как в ядре (small nuclear SN), так и в цитоплазме (small cytoplasmic - SC). в ядре snРНК входят в
состав РНП (рибонуклеопротеидные комплексы), участвующих в
полиаденилировании и сплайсинге.
6. Малая интерферирующая РНК (siRNA) обладает способностью
"выключать" гены.

3. Первичные транскрипты, образующиеся в процессе синтеза РНК, часто подвергаются посттранскрипционным модификациям, или

процессингу.
В результате процессинга происходит созревание РНК. Только зрелые
РНК способны выполнять возложенные на них задачи.
иРНК (или матричные РНК) – это одноцепочечные молекулы. Молекула
иРНК может кодировать одну или несколько полипептидных цепей.
иРНК, кодирующая информацию об одной полипептидной цепи,
называется моноцистронной, о двух или более – полицистронной.
Информационная РНК прокариот короткоживущая. Средняя
продолжительность жизни – 2 минуты.
иРНК прокариот в большинстве случаев являются полицистронными,
и только некоторые из них – моноцистронными. Полицистронные иРНК
содержат нетранслируемые межцистронные области, которые
разделяют участки, кодирующие полипептидные цепи (цистроны). Со
стороны 5’- конца иРНК располагается лидерная некодирующая
последовательность, содержащая в своем составе консенсусную
последовательность Шайна-Дальгарно.

4. Это последовательность из шести нуклеотидов AGGAGG . Комплементарная последовательность UCCUCC, называемая анти

последовательностью Шайна-Дальгарно располагается на 3/ конце
молекулы 16S рРНК и определяет правильную ориентацию иРНК на
рибосоме в процессе трансляции. Со стороны 3’-конца располагается
некодирующая концевая последовательность (трейлер). Кодирующие
последовательности начинаются с инициирующего кодона (обычно АУГ,
но может быть и ГУГ) и заканчиваются одним из терминирующих
кодонов (УАА, УАГ или УГА).
Межцистронные области имеют размер от 1 до 40 и более нуклеотидов.
Иногда межцистронные области могут отсутствовать. Более того,
последний нуклеотид одного цистрона может являться первым
нуклеотидом следующего цистрона, например: АГАУГ.
иРНК эукариот являются моноцистронными и составляют 2 – 6 % от
всей РНК в клетке. У эукариотов гены почти всегда одиночные и только
гены т- и р-РНК собраны в кластеры, напоминающие опероны бактерий.

5.

• В 2006 году была присуждена Нобелевская премия по химии
за исследование транскрипции ДНК у эукариот
• Из 10 000 литров наработанной культуры дрожжей, что
соответствовало 150 кг самих дрожжей, было выделено 2 гр
чистой РНК-полимеразы.
• Корнберг сумел получить кристаллографическую картину
различных состояний аппарата транскрипции, установить
молекулярную структуру РНК-полимераз и других белков,
участвующих в синтезе мРНК, а также выявить механизмы,
регулирующие процесс транскрипции
Роджер Корнберг
Структура
транскрибирующего
комплекса РНКполимеразы II (синяя
спираль - ДНК, красная
- синтезируемая мРНК)

6. Транскрипция у эукариот

• Транскрипция у эукариотов происходит в ядре
• Синтез молекул РНК начинается с промоторов, и завершается в
сайтах терминации.
• У эукариот имеется 3 типа РНК-полимераз (не считая
митохондриальной и хлоропластной):
• РНК полимераза I - синтезирует в ядрышках рибосомные RNA
(18S и 28S рРНК, кроме 5S);
• РНК-полимераза II - синтезирует mRNA и некоторых sRNA;
• РНК-полимераза III - синтезирует tRNA, sRNA, 5S rRNA.

7. Транскрипция у эукариот

Промоторы
ТАТА-бокс
содержащие
ТАТА-бокс не
содержащие
Участвуют различные
транскрипционные
факторы
•На расстоянии 27-30 п.н. от кэп-сайта расположен
TATA-мотив, усредненный вариант которого можно
представить как TATA(A/T)A(A/T).
•Положение TATA-элемента строго определяет сайт
инициации транскрипции, т.е. 5'-конец транскрипта.
•При повреждении или
удалении
TATAэлемента образуется набор молекул РНК с разными 5'концами.
•Отдельные нуклеотидные замены в TATA-элементе
могут приводить к резкому снижению эффективности
транскрипции.
Около 24% генов человека

8. Транскрипция у эукариот

Инициация
•Активация
промотора
происходит
с
помощью большого белка – ТАТА-фактора,
связывающегося с ТАТА-боксом.
• Присоединение ТАТА-фактора облегчает
взаимодействие
промотора с РНКполимеразой.
• Факторы инициации вызывают изменение
конформации
РНК-полимеразы
и
обеспечивают раскручивание примерно
одного витка спирали ДНК, т.е.
образуется транскрипционная вилка,
в которой матрица доступна для
инициации синтеза цепи РНК.
• После
того
как
синтезирован рибоолигонуклеотид из 8-10
нуклеотидных остатков, σ-субъединица
отделяется от РНК-полимеразы, а вместо
неё к молекуле фермента
присоединяются
несколько факторов
элонгации.

9. Транскрипция у эукариот

Элонгация
• Факторы элонгации повышают активность РНКполимеразы и облегчают расхождение цепей ДНК.
• На стадии элонгации, в области транскрипционной вилки,
одновременно разделены примерно 18 нуклеотидных пар
ДНК.
• Растущий конец цепи РНК образует временную гибридную
спираль, около 12
пар нуклеотидных остатков, с матричной цепью ДНК.
• По мере продвижения РНК-полимеразы по матрице в
направлении от 3'- к 5'- концу впереди неё происходит
расхождение, а позади - восстановление двойной спирали ДНК.

10. Транскрипция у эукариот

Терминация
• Завершается синтез РНК в строго определенных участках
матрицы - сайты терминации транскрипции
• Раскручивание двойной спирали ДНК в области сайта
терминации делает его доступным для фактора терминации.
• Фактор терминации облегчает отделение первичного
транскрипта (пре-мРНК), комплементарного матрице, и РНКполимеразы от матрицы. РНК-полимераза может вступить в
следующий цикл транскрипции после присоединения
субъединицы σ.

11. Транскрипция у эукариот

Транскрипционный фактор – регулирует транскрипцию,
специфически взаимодействуя с ДНК, либо стехиометрически
взаимодействуя с другим белком, который может образовывать
специфичный к последовательности ДНК комплекс "белок-ДНК".
• В геноме человека обнаружено более 2600 белков, имеющих ДНКсвязывающий домен, и большинство из них предположительно
являются факторами транскрипции.
• Около 10 % всех генов в геноме кодируют транскрипционные
факторы, являясь самым большим семейством белков человека.

12. Транскрипция у эукариот

ТФ , связывающиеся с ДНК, могут влиять на транскрипцию генов
через несколько механизмов:
1.В большинстве изученных к настоящему времени случаев ТФ
стимулируют формирование комплекса преинициации на TATA- боксе
- инициаторном элементе за счет взаимодействия их трансактивирующих доменов с компонентами базального
транскрипционного комплекса (либо непосредственно, либо через
коактиваторы/ медиаторы ).
2.Некоторые ТФ вызывают изменения структуры хроматина , делая его
более доступным для РНК-полимераз .
3.Другие ТФ являются вспомогательными, создавая оптимальную
конформацию ДНК для действия других транскрипционных
факторов.

13. Транскрипция у эукариот

4. Известны ТФ, которые подавляют транскрипцию за счет
непосредственного действия своих ингибирующих доменов , либо
нарушая совместное функционирование комплекса транскрипционных
факторов внутри регуляторной области гена (промотора, энхансера).
5.Наконец, имеются ТФ, которые сами не связываются с ДНК, а
объединяются в более сложные комплексы посредством белокбелковых взаимодействий.

14. Процессинг матричной РНК

Первичные транскрипты мРНК, прежде чем будут
использованы в ходе синтеза белка, подвергаются
ковалентных модификаций.
Эти
модификации
необходимы
для функционирования мРНК в качестве
матрицы.
Модификация 5'-конца
Модификация 3'-конца
Сплайсинг первичных транскриптов мРНК
Альтернативный сплайсинг
ряду

15. Процессинг матричной РНК

Модификация 5'-конца
• Модификации пре-мРНК начинаются на стадии элонгации.
Когда длина первичного транскрипта достигает примерно 30
нуклеотидных остатков, происходит кэпирование его 5'-конца.
• Осуществляет кэпирование гуанилилтрансфераза. Фермент
гидролизует макроэргическую связь в молекуле ГТФ и
присоединяет нуклеотиддифосфатный остаток 5'-фосфатной
группой
к
5'-концу синтезированного фрагмента РНК с
образованием 5', 5'-фосфодиэфирной связи.

16. Процессинг матричной РНК

Модификация 5'-конца
• Модифицированный
5'-конец
обеспечивает
инициацию
трансляции, удлиняет время жизни мРНК, защищая её от
действия 5'-экзонуклеаз в цитоплазме.
• Кэпирование необходимо для инициации синтеза белка, так как
инициирующие триплеты AUG, GUG распознаются рибосомой
только если присутствует кэп. Наличие кэпа также необходимо
для работы сплайсосомы, обеспечивающей удаление интронов.

17. Кодирующая, или транслируемая, область и (м)РНК начинается с инициирующего кодона (АУГ) и заканчивается одним из трех

терминирующих кодонов. Консенсусная последовательность Козак
(описана Мерилин Козак в 1986 г.), играющая важную роль в
инициации трансляции у эукариот, включает четыре-шесть нуклеотидов,
предшествующих старткодону (САСС чаще всего), и один-два (GC)
нуклеотида непосредственно после старткодона. (Автор рисунка: TransControl из
английской Википедии, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=2296784)

18. У эукариот имеются два механизма нахождения рибосомой старт-кодона AUG: кэп – зависимый (сканирующий) и кэп – независимый

У эукариот имеются два механизма нахождения рибосомой старткодона AUG: кэп – зависимый (сканирующий) и кэп –
независимый (механизм внутренней инициации) за счет
элементов IRES (англ. Internal Ribosomal Entry Site) — участок
мРНК, обладающий выраженной вторичной структурой,
позволяющей ему направлять рибосомы на стартовый AUG.

19.

Модификация 3'-конца
• 3'-Конец большинства транскриптов, синтезированных РНКполимеразой II, подвергается модификации
• Специальным
ферментом
полиА-полимеразой
формируется
полиА-последовательность (полиА-"хвост"), состоящая из 100-200
остатков аденозина.
• Сигналом
к
началу
полиаденилирования
является
последовательность -AAUAAA- на растущей цепи РНК. Фермент
полиА-полимераза,
проявляя
экзонуклеазную
активность,
разрывает 3'- фосфоэфирную связь после появления в цепи
РНК специфической последовательности - AAUAAA-.

20.

Модификация 3'-конца
К 3'-концу в точке разрыва полиА-полимераза наращивает по-лиА"хвост", Наличие полиА- последовательности на 3'-конце облегчает
выход мРНК из ядра и замедляет её гидролиз в цитоплазме.
Ферменты, осуществляющие кэширование и полиаденилирование,
избирательно связываются с РНК-полимеразой II, и в отсутствие
полимеразы неактивны. Полиаденилирование необходимо для
транспорта большинства мРНК в цитоплазму и защиты молекулы
мРНК от быстрой деградации. Лишённые поли(А)-участка молекулы
мРНК быстро разрушаются в цитоплазме клеток эукариот
рибонуклеазами. Период полужизни иРНК эукариот значительно
больше, чем у прокариот, и составляет от нескольких часов до
нескольких суток.

21. Процессинг матричной РНК

Сплайсинг первичных транскриптов мРНК
• Последовательности интронов "вырезаются" из первичного
транскрипта, концы экзонов соединяются друг с другом.
• Гены эукариотов содержат больше интронов, чем экзонов,
поэтому очень длинные молекулы пре-мРНК (около 5000
нуклеотидов) после сплайсинга превращаются в более
короткие молекулы цитоплазматической мРНК

22. Процессинг матричной РНК

Сплайсинг первичных транскриптов мРНК

23. Процессинг матричной РНК

Сплайсинг первичных транскриптов мРНК
Процесс "вырезания" интронов протекает
при
участии
малых
ядерных
рибонуклеопротеинов (мяРНП)
На первой стадии процесса мяРНП
связываются с сайтами сплайсинга
Далее к ним присоединяются другие
мяРНП.
При формировании структуры сплайсосомы
3'-конец одного экзона сближается с 5'концом следующего экзона.
Сплайсосома катализирует
реакцию
расщепления 3',5'-фосфодиэфирной связи
на границе экзона с интроном.
Последовательность интрона удаляется, а
два экзона соединяются.
Образование 3',5'-фосфодиэфирной связи
между двумя экзонами катализируют
мяРНК (малые ядерные РНК), входящие
в структуру сплайсосомы.

24. Процессинг матричной РНК

Альтернативный сплайсинг первичных транскриптов мРНК

25.

У высших организмов первичный РНКтранскрипт может подвергаться альтернативному
сплайсингу. При этом в определенных случаях
могут удаляться и некоторые из экзонов вместе с
интронами, а некоторые интроны или их части
оставаться в зрелой mРНК и служить матрицей
для синтеза полипептидной цепи. Именно
альтернативным сплайсингом объясняется тот
факт, что у человека синтезируется не менее 105
разных типов белков, кодируемых всего ~ 20 *
103 генами. Из всех генов человека, содержащих
интроны, более 75 % служат матрицами для
синтеза прe-mРНК, подвергаемых
альтернативному сплайсингу.

26.

В результате альтернативного сплайсинга по каждому
гену высших эукариот может образовываться в среднем
три разных mРНК, а по некоторым генам даже
несколько тысяч. Так, по гену Slo, экспрессирующемуся
в волосковых клетках внутреннего уха человека,
теоретически возможно образование более 30 000
разных mРНК. Ген содержит 35 экзонов, 8 из которых
альтернативны. Разные формы белка Slo определяют
различия в частоте звуков, воспринимаемых клетками.
Известно несколько разных механизмов сплайсинга.
Наиболее сложным из них является сплайсинг mРНК
ядерных генов высших эукариот. Он осуществляется
сплайсосомой – рибонуклеопротеидным комплексом,
включающим 5 малых ядерных РНК (U1, U2, U4, U5) и
более 100 белков.

27.

Некоторые белки напрямую участвуют в сплайсинге, большая
их часть играет структурную роль и необходима для сборки
малых ядерных рибонуклеопротеидных комплексов и их
взаимодействий между собой и с пре-mРНК. Описано
несколько десятков белковых комплексов, называемых
SRбелками (сплайсинг- регулирующими), которые различны в
разных тканях, а также в одной ткани на разных этапах
развития организма. Эти богатые серином и аргинином белки
связываются с определенными нуклеотидными
последовательностями внутри экзонов и сигнализируют о
вырезании или сохранении конкретного экзона в mРНК. Если
они связываются с экзонным энхансером сплайсинга (ESE),то
на 5′-конце соседнего интрона начинается формирование
сплайсосомы. Если же другие SR-белки связываются с
экзонным супрессором сплайсинга (ESE), тогда блокируется
присоединение малых РНК сплайсосомы к фланкирующим
интронам, что приводит к вырезанию этого экзона вместе с
интронами. (Г.М. Дымшиц, О.В. Саблина «Разорванные» гены и сплайсинг. // Вавиловский журнал генетики и селекции,
2014, Том 18, № 1 C. 71-80.
)

28. Стабильность и время жизни матричной РНК

• У некоторых мРНК в их 3'-UTR районах встречаются ARE элементы
(AU-rich element), с высокой частотой аденина (A) и уридина (U)
• Связывание ряда белков из семейства RBP (RNA-binding proteins) с ARE
элементом индуцирует деградацию мРНК.
• Гены раннего ответа, которые отвечают на широкий спектр внешних
сигналов, включая онкогены и цитокины, имеют относительно короткое
время жизни из-за ARE элементов в их мРНК
• Другой тип RBP белков, включая HuR, связываясь с ARE регулирует
стабильность мРНК за счет препятствия доступа к ней эндонуклеаз.

29. Транспорт матричной РНК

• Зрелые мРНК распознаются по наличию модификаций и
покидают ядро через ядерные поры
• В цитоплазме мРНК образует нуклеопротеидные комплексы —
информосомы, в составе которых транспортируется к рибосомам
• Многие мРНК содержат сигналы, которые определяют их
локализацию

30. Рибосомы. В прокариотических рибосомах присутствуют три вида рРНК и 55-60 рибосомных белков. Образование рРНК у прокариот

происходит в результате процессинга первичного транскрипта,
содержащего в своем составе нуклеотидные последовательности всех
трех 16S, 23S и 5S рРНК, а также тРНК. При созревании из первичного
транскрипта происходит вычленение индивидуальных рРНК и тРНК.
Полная прокариотическая рибосома имеет коэффициент седиментаци
и 70S и диссоциирует на две субъединицы. Малая рибосомальная
субъединица имеет палочковидную форму с несколькими небольшими
выступами и состоит из одной молекулы РНК. Большая субъединица
похожа на полусферу с тремя торчащими выступами. При ассоциации в
полную 70S рибосому малая субчастица ложится одним концом на один
из выступов 50S частицы, а другим в ее желобок. В составе большой
молекулы находятся 2 молекулы РНК.

31. В эукариотических – 4 рРНК и 70-85 рибосомных белков. Полная эукариотическая рибосома, 80S рибосома, диссоциирует на малую и

большую субъединицы похожие на таковые прокариот, но большая
состоит не из двух, а из 3 молекул РНК. Суммарно в состав
эукариотической рибосомы входят четыре молекулы РНК разной длины:
28S РНК содержит 5000 нуклеотидов, 18S РНК – 2000, 5,8S РНК – 160,
5S РНК – 120 нуклеотидов. (M.M. Yusupov, G.Zh. Yusupova, A. Baucom, K. Lieberman, T.N. Earnest,
J.H.D. Cate, H.F. Noller (2001) Science 292: 883-896
16S ribosomal RNA
)
23S ribosomal RNA

32. Из них 18S, 5,8S и 28S рРНК синтезируются в ядрышке РНК полимеразой I в виде единого предшественника (45S), который затем

подвергается модификациям (метилируется, преимущественно остатки
рибозы) и нарезанию. 5S рРНК синтезируется РНК полимеразой III в
другой части генома и не нуждаются в дополнительных модификациях.
Затем при участии 5S рРНК формируют рибосомы. У некоторых
примитивных эукариот в составе первичного транскрипта нуклеотидные
последовательности, соответствующие 26S РНК, содержат интрон. В
результате процессинга из первичного транскрипта не только
вырезаются индивидуальные рРНК, но и удаляется интрон посредством
аутосплайсинга. Для приобретения функциональной активности РНК в
большинстве случаев должна подвергнуться сложнейшим
посттранскрипционным модификациям.
Почти вся рРНК находится в виде магниевой соли, что необходимо
для поддержания структуры. При удалении ионов магния рибосома
подвергается диссоциации на субъединицы. Синтез рибосом у эукариот
происходит в специальной внутриядерной структуре - ядрышке.

33.

Количество ядрышек в клетках обычно от1 до 5, но оно не постоянно, например,
в половых клетках количество ядрышек может достигать несколько сотен.
Увеличение числа ядрышек называется амплификацией ядрышек. Число
ядрышек зависит от «ядрышковых организаторов», которые локализованы во
вторичных перетяжках хромосом. Чем больше число «ядрышковых
организаторов», тем больше ядрышек. Число ядрышек увеличивается согласно
плоидности ядра. Количество ядрышек меньше числа «ядрышковых
организаторов», так как «ядрышковые организаторы» могут сливаться.
«Ядрышковые организаторы» представляют полицистронные
участки, которые содержат множество одинаковых генов (полиизогенные
участки), т.е. рибосомные гены. В ядрах встречаются ядрышки, не связанные с
ядрышковыми организаторами. Их копии могут либо включаться в состав
хромосом, либо становиться свободными. В структуре ядрышка различают:
Глобулярный центр, фибриллярный центр, плотный фибриллярный компонент
(ПФК), хроматин, белковый сетчатый матрикс. На поверхности фибриллярного
центра происходит активация транскрипционных единиц – связывание с
факторами транскрипции и РНКполимеразой I, которая начинает считывать
первичный транскрипт рРНК. По мере прохождения первой РНК-полимеразы на
освобождающийся участок транскрипционной единицы садится следующая
РНК-полимераза и начинается синтез новой рРНК.

34.

рРНК катализирует пептидилтрансферазную реакцию, в
результате которой происходит образование пептидных связей в
процессе синтеза белка на рибосомах. Созревание рибосом
заканчивается образованием функционального
рибонуклеопротеида (конмплекс рРНК и белков).
Рибосомные белки. Во-первых, рибосомные белки располагаются
преимущественно на обращенной к растворителю поверхности
рибосомы, а между субчастицами белков практически нет.
Во-вторых, большинство рибосомных белков имеют глобулярную
конформацию, однако некоторые содержат вытянутые
нерегулярные участки, которые приобретают упорядоченную третичную
структуру при связывании с рРНК. Были обнаружены также белки,
которые не имеют глобулярной формы, например, белок S14.
В-третьих, главной ролью рибосомных белков, по-видимому, является
роль «скрепок», стабилизирующих структуру рРНК. Тем не менее, часть
рибосомных белков может играть самостоятельную роль в составе
рибосомы.
В-четвертых, вторичная структура рРНК почти полностью состоит из
элементов известных ранее для малых фрагментов РНК.

35.

Двухнитевые спиральные элементы рРНК соединены петлями, которые часто
представляют собой нерегулярные участки А-спиралей РНК, и
взаимодействуют между собой малыми желобками (аналогично упаковке
интрона I рибозима). Часто такие взаимодействия стабилизированы
внедрением аденина в малый желобок спирали рРНК или взаимодействиями
фосфатной группы одной спирали с малым желобком второй, а также
взаимодействиями неспаренных пуринов в двух перпендикулярных спиралях
РНК. Рибосомные белки, взаимодействующие с рРНК независимо от других
белков и связывающиеся только со специфическими участками рРНК,
Называются сердцевинными или первичными РНК- связывающими
Рибосомными белками. Остальные рибосомные белки также связываются с
рРНК, но участки связывания этих белков формируются только после
Связывания сердцевинных белков. В настоящее время модели рибосомных
субчастиц активно используются для определения положения антибиотиков
на рибосоме и предсказания их контактов с рРНК.

36. Молекулы тРНК состоят примерно из 75 нуклеотидов и начинаются с фосфорилированного 5'-конца. Первым основанием обычно является

гуанин. На
З'-конце всегда присутствуют три основания - ССА и концевая ОН-группа. На
долю тРНК приходится около 10 – 15 % общего количества клеточной РНК. В
тРНК присутствуют модифицированные (минорные) азотистые основания
(псевдоуридин, дигидроуридин, тимидин, 7-метилгуанозин, инозин и др.). Их
доля может достигать до 25 %. Более половины оснований тРНК образуют
внутрицепочечные пары по принципу комплементарности.
тРНК узнает соответствующий кодон в
мРНК и переносит нужную аминокислоту
к растущей полипептидной цепи.
Узнавание кодона в мРНК существляется
с помощью трех последовательных
оснований в тРНК, называемых
антикодоном. Между азотистыми
основаниями кодона и антикодона
образуются уотсон-криковские водородные связи
при условии, что полинуклеотидные
цепи антипараллельны.

37.

Участки, в которых посредством Н-связей образовались пары
оснований, называются стеблями, а одноцепочечные участки —
петлями. Все известные тРНК образуют «клеверный лист» с
четырьмя стеблями (акцепторным, D, антикодоновым и Т) и тремя
петлями (D, антикодоновой и Т). Некоторые тРНК имеют
дополнительные петли и/или стебли (например, вариабельная
петля дрожжевой фенилаланиновой тРНК). Каждый стебель
состоит из двух антипараллельных цепей, образующих правую двойную
спираль, известную как А-форма РНК. Эта форма содержит 11 пар
оснований на виток, шаг спирали равен 3.1 нм. Плоскости оснований
составляют около 20° с нормалью к оси двойной спирали. А-форма РНК
близка к аналогичной форме ДНК. РНК не способна менять
конформацию и переходить в В-форму, что обусловлено наличием 2'-ОН
группы в рибозе, которой нет в дезоксирибозе. Пространственная
(третичная) структура молекулы тРНК напоминает по форме букву Г.
«Перекладину» этой буквы образует спираль из акцепторного и Тстеблей, а антикодоновый и D-стебли формируют «ножку». В каждой
части содержится примерно 10 пар оснований.

38.

Аминокислотный остаток присоединяеться к З'-концу молекулы тРНК.
Специфичность такой системы переноса обеспечивается тем, что
имеется, по крайней мере, одна тРНК для каждой аминокислоты. Так,
тРНК для Рhе обозначается тPHKPhe.
Следует подчеркнуть, что Ф, участвующие в транскрипции, являются
мишенями для ряда БАВ, в частности антибиотиков и токсинов. Например,
токсин бледной поганки - α-аманитин - блокирует РНК-полимеразу II эукариот,
что приводит к прекращению синтеза новых молекул мРНК и многих жизненно
важных белков. Таким образом, формируется вторичная структура, получившая
название клеверного листа. В ней выделяют:
а) дигидроуридиловую ветвь, содержащую до 3 остатков дигидроуридина;
б) псевдоуридиловую ветвь, содержащую минорные азотистые основания
псевдоуридина;
в) антикодоновую ветвь, в центре которой находится антикодон, который
комплементарен в антипаралельном направлении кодону иРНК;
г) дополнительную ветвь. Число составляющих ее нуклеотидов варьирует от 3
до 20. В некоторых тРНК данная ветвь отсутствует;
д) акцепторную ветвь с универсальной 3'-концевой последовательностью ЦЦА,
служащей акцептором остатка аминокислоты. Который присоединяется к 3’-или
2’-гироксильной группе остатка рибозы последнего нуклеотида .

39.

Каждая аминокислота, как правило, имеет несколько соответсвующих ей
тРНК, которые называются изоакцепторными. Изоакцепторные тРНК
отличаются антикодонами и используются для считывания разных
кодонов иРНК, соответствующих одной и той же аминокислоте. Общее
число генов тРНК в различных организмах сильно варьирует
(у Escherichia coli их около 70, у шпорцевой лягушки Xenopus laevis
около 7 000, у человека – 1300.). Каждый ген тРНК может быть
представлен в геноме десятками копий. Почти все тРНК синтезируются
в виде предшественников – более длинных молекул (пре-тРНК). В
результате процессинга происходит удаление нуклеотидных
последовательностей с флангов пре-тРНК. С 5’-конца фрагмент
нуклеотидной цепи отщепляет фермент, называемой РНКазой Р.
РНКазой P является рибонуклеопротеином, каталитическую функцию в
котором осуществляет РНК-компонент, белок же выполняет структурную
роль. В бактериальной РНКазе P есть участок, комплементарный ЦЦА
участку тРНК. Эукариотическая РНКаза P узнает другие элементы
предшественника тРНК. С 3’-конца пре-тРНК действует экзонуклеаза,
укорачивающая РНК постепенно, удаляя по одному нуклеотиду.

40.

На заключительных стадиях созревания тРНК к 3’-концу
полинуклеотидилтрансфераза присоединяет последовательность ЦЦА.
У эукариот ЦЦA- последовательность не кодируется в генах тРНК,
Она добавляется посттранскрипционно. У прокариот первичный
транскрипт может содержать несколько последовательностей тРНК,
их процессинг включает вырезание индивидуальных молекул тРНК. В
процессе созревания тРНК также происходит модификация
азотистых оснований – в результате которой образуются минорные
основания: псевдоуридин, дигидроуридин, тимидин,
7-метилгуанозин, инозин и др.
Канонические последовательности на границе интрона и экзона,
характерные для пре-иРНК, у пре-тРНК отсутствуют. В тоже время в
составе интронов имеются последовательности комплементарные
антикодону. Спаривание этих последовательностей с антикодоном,
по-видимому, и обуславливает формирование структур,
обеспечивающих протекания сплайсинга.

41.

• В последние годы была установлена роль
коротких отрезков РНК (малых РНК).
Понятно, что с первого взгляда малые РНК,
состоящие всего из нескольких десятков
нуклеотидов, могли показаться остатками от
своих «больших братьев». И даже несмотря на
то, что роль отдельных малых молекул РНК в
процессах превращения информационных
РНК (сплайсинге), а также при упаковке нитей
нуклеиновых кислот, была доказана ранее,
истинным «хитом» в биологии малые РНК
стали только лишь с открытием своей
способности подавлять экспрессию генов у
животных.

42.

• В нормально работающей клетке каждый ген выполняет
собственную, строго определенную функцию.
Например, отвечает за выработку белка, мРНК, или за
взаимодействие с другими регуляторными белками.
• При этом говорят о нормальной экспрессии (от лат.
expressus - выразительный, явный) гена в клетке. Если
же количество продукта данного гена (например, белка)
снижается, то говорят о снижении экспрессии данного
гена. Эффект «гашения» экспрессии определенных
генов малыми РНК получил название РНК интерференции, а молекулы, вызывающие его, назвали
siRNA (small interfering Ribonucleic Acids - малые
интерферирующие рибонуклеиновые кислоты). С
открытием siRNA - интерференции стало ясно, что этот
феномен может иметь огромное практическое значение.

43. РНК интерференция

Нобелевскую премию за открытия в области медицины и физиологии
в 2006 году получили в равных долях американские ученые Эндрю
Файр (Andrew Z. Fire. Гражданин США. Профессор кафедры
патологии и генетики Медицинской школы Стэнфордского
университета, США) и Крэйг Меллоу (Craig C. Mello. Гражданин
США. Профессор кафедры молекулярной медицины Медицинской
школы Университета Массачусетса, США) за "открытие РНКинтерференции - подавления генов двухцепочечной РНК".
Малая интерферирующая РНК (siRNA) обладает способностью
"выключать" гены, воздействуя на процесс передачи
"инструкций" между ДНК и всей остальной «машинерией»
клетки.
Обладает исключительной специфичностью по отношению к
своему гену-мишени. Основная функция этого механизма –
защита наследственной информации. Механизм, связанный с
siRNA предохраняет нас как от спорадических мутаций, так и от
внешних атак на нашу наследственную информацию.

44.

РНК-интерференция (RNAi, RNA interference) — специфическая
деградация молекул РНК с помощью образования двухцепочечных
молекул РНК (siRNA) и их избирательной деградации

45.

• В класс малых РНК включают молекулы, содержащие от 20 до
300 нуклеотидов. За эффект РНК - интерференции отвечают
самые короткие из них - siRNA, состоящие всего из 21-28 (у
млекопитающих из 21-23) нуклеотидов. Особенностью этих
молекул является то, что они, в отличие от большинства других
клеточных РНК, состоящих всего из одной цепи нуклеотидов,
являются двунитчатыми. Нуклеотиды с противоположных
нитей (цепей) siRNA спариваются друг с другом по тем же
законам комплементарности, которые формируют двунитчатые
цепи ДНК в хромосомах. Кроме того, по краям каждой из цепей
siRNA всегда остается два неспаренных нуклеотида. Как siRNA
появляются в клетке? Очевидно, в клетке должен существовать
некий молекулярный механизм, который обеспечивал бы синтез
siRNA, их накопление в клетке и позволял бы им выключать
гены. Ученым удалось выявить систему ферментов, которая во
многом схожа у всех многоклеточных и некоторых
одноклеточных организмов.

46.

• Если молекула siRNA по тем или иным причинам (например, по
воле исследователя) появляется в клетке, ее сразу же «берет в
оборот» специальная клеточная система белков, для которых
появление siRNA является сигналом к немедленному действию.
На первом этапе с молекулой siRNA связываются белкиферменты хеликаза и нуклеаза, формируя комплекс RISC (RNAinduced silencing complex; silence - англ. молчать, замолкать;
silencing - замолкание, так в англоязычной и специальной
литературе называют процесс «выключения» гена). Хеликаза
раскручивает нити siRNA, в результате чего они расходятся.
Одна из этих нитей, к которой прикреплен фермент нуклеаза,
может теперь связаться с комплементарным участком
однонитчатой мРНК, позволяя нуклеазе разрезать ее.
Разрезанные же участки мРНК подвергаются действию других
клеточных РНКаз, которые доразрезают их на более мелкие
куски.

47.

• Итак, основная «специальность» siRNA в клетке - это
блокирование тех генов, которые соответствуют одной из
цепочек внутри siRNA. С помощью siRNA клетка может
защищать себя от проникновения вирусов. Геном некоторых из
этих опасных варваров состоит из ДНК, у некоторых же - из
РНК, причем, против обычных правил, РНК у вирусов может
быть как одно-, так и двунитчатой. Сам процесс разрезания
чужеродной (вирусной) мРНК в этом случае происходит путем
активаций комплекса ферментов RISC. Однако для большей
эффективности растения и насекомые изобрели своеобразный
путь усиления защитного действия siRNA. Присоединяясь к
цепи мРНК, участок siRNA может с помощью комплекса
ферментов, называемого DICER, сначала достроить вторую
цепочку мРНК, а затем разрезать ее в разных местах, создавая,
таким образом, разнообразные «вторичные» siRNA. Они, в
свою очередь, формируют RISC и проводят мРНК через все
стадии, о которых шла речь выше, вплоть до ее полного
уничтожения.

48.

• Такие «вторичные» молекулы смогут специфично
связываться не только с тем участком вирусной мРНК, к
которому была направлена «первичная» молекула, но
также и с другими участками, что резко усиливает
эффективность клеточной защиты.
• Таким образом, у растений и низших животных
организмов siRNA являются важным звеном
своеобразного «внутриклеточного иммунитета»,
позволяющего распознавать и быстро уничтожать
чужую РНК. В том случае, если в клетку проник РНК содержащий вирус, такая система защиты не даст ему
размножиться. Если же вирус содержит ДНК, система
siRNA будет мешать ему производить вирусные белки
(так как необходимая для этого мРНК будет
распознаваться и разрезаться), и с помощью этой
стратегии, замедлит его распространение по организму.

49.

• У млекопитающих же, в отличие от насекомых и
растений, работает и другая система защиты. При
попадании в «зрелую» (дифференцированную)
клетку млекопитающего чужой РНК, длина которой
больше 30 нуклеотидов, клетка начинает синтез
интерферона. Интерферон, связываясь со
специфическими рецепторами на клеточной
поверхности, способен стимулировать в клетке
целую группу генов. В результате в клетке
синтезируется несколько видов ферментов, которые
тормозят синтез белков и расщепляют вирусные
РНК. Кроме того, интерферон может действовать и
на соседние, еще не зараженные клетки, блокируя
тем самым возможное распространение вируса.

50.

• Как можно заметить, обе системы во многом схожи:
у них общая цель и «методы» работы. Даже сами
названия «interferon» и «(RNA) interference»
происходят от общего корня. Но есть у них и одно
очень существенное различие: если интерферон при
первых признаках вторжения просто
«замораживает» работу клетки, не позволяя (на
всякий случай) производство многих, в том числе и
«невиновных» белков в клетке, то система siRNA
отличается чрезвычайной разборчивостью: каждая
siRNA будет распознавать и уничтожать только
свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь
одного нуклеотида внутри siRNA ведет к резкому
снижению эффекта интерференции.

51.

• В этом и заключается основное преимущество малых
РНК: ни один из блокаторов генов, известных до сих
пор, не обладает такой исключительной
специфичностью по отношению к своему гену-мишени.
Однако, как видно на примере многих опасных
вирусных заболеваний у людей, ни иммунная, ни
интерфероновая защита не всесильны, так что нам
самое время позаимствовать у кого-нибудь передовой
опыт в борьбе с вирусами. Почему бы не у растений или
у насекомых? Ни те, ни другие не обладают системой
адаптивного иммунитета. Чтобы выжить, растения были
вынуждены «изобрести» РНК - интерференцию, которая
до сих пор успешно защищает их клетки от внедрения
вирусов. Появляется вполне закономерный вопрос:
нельзя ли применить этот же подход в отношении
клеток животных и людей?

52.

• Геном любого многоклеточного организма включает в
себя множество элементов, которые когда-то были
привнесены в него в процессе эволюции извне,
например как результат встраивания вируса. Судите
сами: из всего материала, содержащегося в наших с
вами хромосомах, 34% приходится на долю элементов,
называемых LINEs и SINEs (соответственно, Long и
Short Interspersed Nuclear Elements), о функциях которых
известно только то, что они могут по временам
копировать себя и перемещаться с одного места
хромосомы на другое; те участки ДНК, которые
достались нам от ретровирусов (8% генома) и
транспозоны (3%) также способны менять свое место в
геноме. На их фоне всего лишь 2 (два(!)) процента
собственно генов, кодирующих наши клеточные белки,
кажутся такой же маловажной деталью, как и siRNA
среди огромного разнообразия своих больших «сестер».

53.

• LINEs, SINEs, остатки вирусной ДНК и транспозоны, за свою
способность к перемещениям именуемые подвижными, или
мобильными элементами генома, представляют значительную
опасность для наших хромосом. «Чужие среди своих», они при
определенных обстоятельствах могут поднять бунт и привести к
внутриклеточному хаосу. Некоторые из них - остатки вирусов,
или протоонкогены - способны при «включении» вызывать рак;
мобильные элементы, размножаясь и перемещаясь, меняют
структуру хромосом, что может привести к мутациям.
Например, у излюбленного объекта генетических исследований
- плодовой мушки дрозофилы - более 80% спонтанных мутаций
возникают именно из-за «хулиганского» поведения ее
собственных мобильных элементов. Их перемещения внутри
генома так индивидуальны и непредсказуемы, что положение
некоторых из них может служить «молекулярным паспортом»,
точно определяющим личность хозяина, что уже используется
на практике.

54.

• Система внутриклеточных siRNA выполняет «надзирательскую»
функцию за поведением мобильных элементов. На модели все того же
С. elegans, например, было показано, что отключение генов,
кодирующих некоторые из малых РНК, ведет к активизации
перемещений мобильных элементов в его хромосомах и,
соответственно, к повышению уровня мутаций.
• Кроме того, ошибки в развитии органов и тканей при отключении
генов, кодирующих систему siRNA у подопытных животных, а также
ее активность в «незрелых» клетках указывают на то, что механизм
РНК - интерференции активно участвует в регуляции программы
«созревания» клеток и, как следствие, может играть одну из ключевых
ролей в формировании целостного организма.
• Еще одна из предполагаемых нормальных функций siRNA отслеживание неправильно обработанных копий других типов РНК в
клетке.
• Имеются данные, что в некоторых случаях siRNA, видимо,
воздействует прямо на ДНК, изменяя структуру хроматина и
способствуя длительному «замолканию» одних, и, возможно,
активизации других генов.

55.

МУЛЬТИФУНК ЦИОНАЛЬНОСТЬ РНК
(1) Кодирующая функция:
программирование белкового синтеза линейными
последовательностями
полирибонуклеотидов.
(2) Репликативная функция:
репликация генетического материала через
комплементарные последовательности полинуклеотидов.
(3) Структурообразующая функция (формирование
трехмерных структур):
само-сворачивание линейных полирибонуклеотидов в
уникальные компактные конформации.
(4) Функция специфического узнавания лигандов:
специфические пространственные взаимодействия с
другими
макромолекулами и малыми лигандами.
(5) Каталитическая функция:
специфический катализ химических реакций рибозимами.

56.

КОДИРУЮЩИЕ ФУНКЦИИ РНК
(1) РНК (как и ДНК!) могут служить матрицей для собственного воспроизведения
через комплементарные цепи РНК:
1962-1964 – открытие самовоспроизведения полиовирусной РНК
в животных клетках (D. Baltimore).
1965-1966 – открытие самовоспроизведение РНК бактериофагов типа
R17 и MS2 в бактериальных клетках (S. Spiegelman).
(2) РНК могут служить матрицей для синтеза ДНК:
1970 – открытие обратной транскрипции
(H.M. Temin, D. Baltimore).

57.

КАТАЛИТИЧЕСКАЯ ФУНКЦИЯ РНК
(РИБОЗИМЫ)
(1) Открытие природных рибозимов:
K. Kruger, P.J. Grabowski, A.J. Zaug, J. Sands, D.E. Gottschling and T.R. Cech (1982) Self-splicing RNA:
Autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequences of Tetrahymena. Cell 31: 147157.
C. Guerrier-Takada, K. Gardiner, T. Marsh, N. Pace and S. Altman (1983) The RNA moiety of ribonuclease P is
the catalytic subunit of the enzyme. Cell 35: 849-857.
(2) Создание искусственных рибозимов:
D.L. Robertson and G.F. Joyce (1990) Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves singlestranded DNA. Nature 344: 467-468.
Reviewed in: T.R. Cech and B.L. Golden (1999) Building a catalytic active site using only RNA. In The RNA
World, 2nd Edition (Eds. R.F. Gesteland et al.), CSHL Press, New York.

58.

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ (ЕСТЕСТВЕННАЯ И ИССКУСТВЕННАЯ)
ФУНКЦИИ РНК (РИБОЗИМЫ)
• Гидролиз фосфоэфирных связей
• Трансэстерификация
• Лигирование и полимеризация нуклеотидов, в том числе на
матрице ДНК или РНК
• Алкилирование и аминоацилирование нуклеотидов
• Синтез амидных (пептидных) связей между аминокислотами
• Транспептидация
• Синтез углерод-углеродных связей

59.

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ (ЕСТЕСТВЕННАЯ И ИССКУСТВЕННАЯ)
ФУНКЦИИ РНК (РИБОЗИМЫ)
• Гидролиз фосфоэфирных связей
• Трансэстерификация
• Лигирование и полимеризация нуклеотидов, в том числе на
матрице ДНК или РНК
• Алкилирование и аминоацилирование нуклеотидов
• Синтез амидных (пептидных) связей между аминокислотами
• Транспептидация
• Синтез углерод-углеродных связей

60.

ФУНКЦИЯ УЗНАВАНИЯ МАЛЫХ
ЛИГАНДОВ (СУБСТРАТОВ)
(1) E. Cundliffe (1986) Involvement of specific portions of ribosomal
RNA in defined ribosomal functions: A study utilizing antibiotics. In
Structure, Function, and Genetics of Ribosomes (Eds. B. Hardesty
and G. Kramer), p.p. 128-142. Springer-Verlag, New York.
«До сих пор не подозреваемая способность РНК узнавать
малые молекулы».
(2) Открытие и создание аптамеров. Методология SELEX’a.
А. Ellington and J. Szostak (1990) In vitro selection of RNA
molecules that bind specific ligands. Nature 346: 818-822.
C. Tuerk and L. Gold (1990) Systematic evolution of ligands by
exponential enrichment. Science 249: 505-510.

61.

ФУНКЦИЯ УЗНАВАНИЯ МАЛЫХ
ЛИГАНДОВ (СУБСТРАТОВ)
(3) Демонстрация специфических взаимодействий
природных РНК с малыми молекулами.
D. Fourmy, M.I. Recht, S.C. Blanchard and J.D. Puglisi (1996)
Structure of the A site of E. coli 16S rRNA complexed with an
aminoglycoside antibiotic. Science 274: 1367-1371.
Трехмерные структуры комплексов
РНК с аминогликозидными
антибиотиками.
(a) Paromomycin-A-site RNA complex.
(b) Tobramycin-RNA aptamers
complex.
Reproduced from J.D. Puglisi and J.R.
Williamson (1999) In The RNA World,
2nd Edition (Eds. R.F. Gesteland et al.),
CSHL Press, New York.

62.

Таким образом, рибонуклеиновые кислоты
способны осуществлять все основные функции,
свойственные как ДНК, так и белкам.
Следовательно, ансамбли молекул РНК
с разными взаимодополняющими функциями
могут быть самодостаточными в качестве
ассимилирующих, метаболизирующих,
структурообразующих и реплицирующихся
систем, т. е. быть прототипами живых систем.