Микроорганизмдерді дақылдаудың негіздері

1. №13 Лекция Тақырыбы: Микроорганизмдерді дақылдаудың негіздері

2. Қамтылатын сұрақтар:

Микроорганизмді беттік және
тереңдік дақылдау әдістері
“Микроорганизмдер таза
дақылдары” тұжырымдамасы
Жиынтықты дақыл алу әдісі
Бөлінген дақылдардың тазалығын
анықтау әдістері
Таза дақылдарды бөлу әдістері
Тығыз ортадағы массалық культура

3. Беттік дақылдау әдісі :

Беттік
дақылдау
кезінде
(моноқабатты)
ұнтақталынған трипсин эмбрион ұлпасын өңдеу арқылы
жасушалық суспензиясын алады. Осындай суспензияда
жасуша культуралды ортаның қалың бетіне тұнып,
ыдыстың бетіне моноқабат түзіліп, жалпақ болып
бөлінеді.
Бұл дақылдау
тәсілінде негізінен өз өсінен баяу
айналатын цилиндрлі бутылды қолданады. Жасушаның
өсуі мен биомасса шығынын, суспензияға – жасушалар
жабысып және инертті синтетикалық полимерден
алынған микроскопиялық түйіршіктер қоса отырып
арттырады. Суспензиялық культураны көлемі 1000 л
ыдыста араластыра отырып алуға болады.

4. Терең дақылдау кезінде:

• Дақылдаудың бұл түрінде қоректік ортаның
барлық көлемін пайдалану мүмкіндігі бар.
Терең дақылдауда микроорганизмдерді өсіруге
болады:
үздікті әсердегі ферментерде;
субстратты қоса отырып
әсердегі ферментерде;
үздіксіз культурада.
үздікті

5.

• Бірінші жағдайда микроорганизмдерді жаңа
культуралды
ортаны
ферменттациялау
кезінде қоспасыз стерилді жағдайда өсіреді.
• Үздікті ферментациялау кезінде культуралды
орта
құрамы,
микроорганиздердің
концентрациясы,
ақуызды
өнімдердің
мөлшері немесе метоболиттердің өсу
фазасына, жасуша метоболизімі және
қоректік заттардың бар болуына тәуелді.

6. Бактериялардың өсу фазалары:

Өлімнің тежелу фазасы
Логарифмдік өлім
Өлімнің жылдамдауы
Стационарлық фаза
Баяулау фазасы
Экспоненциальды немесе логарифм
фазасы
Жылдамдату фазасы
Лаг – фаза
Әуелгі фаза

7.

8. Бактериялардың өсу фазалары:

Әуелгі (1-2 сағ) – бактериялардың клеткаларының
саны өзгермейді, аз ғана өседі
Көбеюдің кідіруі (лаг-фаза) - физиологиялық
бейімделу
кезеңі,жаңа
ферменттер
индукциясын,рибосоманың жиыны мен синтезін
қосады.
Бастапқы
интенсивті
жасушаның
өсуі,бірақ бөліну жылдамдығы жоғары емес.
Экспоненциалдық
фаза
(логарифмдік)
–
жасушалардың тұрақты түрде максималдық
жылдамдықпен бөлінуімен сипатталады. Бұл
жылдамдық бактерия мен жылдамдық түріне
байланысты болады. Бактериялардың арту уақыты
генерациялану уақыты деп аталады, бұл уақыт
бактерия түріне байланысты әртүрлі болады.Мыс:
псевдоманад-14 мин, туберкулез таяқшасы-24 сағ.

9.

Өсу жылдамдығының азаюы (2 сағ) –
бактериальді жасушалардың активтілігінің
төмендеуі және генерация кезеңінің ұзаруы
ортада
қоректік
заттардың
азаюынан
болады,онда метаболизм өнімдерінің көбеюі
және дақылдың ескіруі болады;
Тұрақты (стационарлы) (2 сағ) – тыныштық
кезеңінде
пайда
болған
және
өлген
жасушалардың саны арасындағы тепе-теңдік
болады.
Спора
түзетін
бактериялар
(бациллалар,клостридиялар)
споруляция
кезеңіне өте алады;
Өлімнің жылдамдауы (бірнеше сағаттан,
бірнеше аптаға дейін);
Логарифмдік өлім (3 сағ);
Өлімнің жылдамдылығының тежелу фазасы.

10. Микроорганимздерді дақылдауға арналған қоректік орта және олардың түрлері :

I.
II.
Табиғаты бойынша:
1. Табиғи – өзгермейтін жіпшелік компоненттер
(қан сарысуы, жұмыртқа ақуызы және т.б.);
2. Жасанды – тағам өнімдерінен жасайды, тиісті
өңдеу жолымен
3. Синтетикалық – дәл қойылған дозировкадағы
таза химиялық қосылыстардың ерітінділерінен
тұрады.
Құрамы бойынша:
1. Қарапайым
2. Күрделі

11.

• Табиғи қоректік орта – құрамы белгісіз табиғи
субстраттар негізінде жасалады.
• Табиғи орта түрлері: сүт, жұмыртқа, көң, ет, топырақ, балық,
тағамдық өсімдіктер, экстракттар, шырындар және т.б. табиғи
заттар жатады.
• Табиғи қоректік орталарды ашытқы экстракттарында,
ашытқы автолизатта, етті экстрактта немесе пептонда және
аралас қанда жүзеге асыруға болады.
• Микроорганизмдердің белгілі бір өкілдері үшін дайындалатын
қоректік орта сыра суслосында, қамыс қайнатпасында,
көкөністік және жеміс-жидектік шырындарда, теңіз
суларында, көл суларында және минералды таза суларда
жүреді. Қоректік ортаның ақшалай құнын арзандату үшін –
таза
қосылыстардың
орнына
сүт
сывороткасы,
меласса,жүгері настойы, дәндердің экстакттары сияқты
күрделі өндірістік қалдықтар қосылады.

12. Жасанды қоректік орта немесе жартылай синтетикалық орта

• Мұндай орталар табиғи субстраттар мен
белгілі химиялық қосылыстардан тұрады.
Мысалы: пептон,калий фосфат,еттен алынған
түрлі сығындылар, қан, сарысу, түрлі тұздар.
• Көптеген органикалық қосындыларға бай,
бірақ құрамы тұрақты емес мысалы ет
пептонды сорпа, сүттің таза, май мөлшері аз,
гидролизденген
түрлері,
сүтті-пептонды
сыворотка, ашытқы су, картопты орта және т.б.
жасанды қоректік ортаның мысалы бола
алады.

13. Синтетикалық қоректік орта

• Синтетикалық қоректік орта белгілі
концентрацияда нақты химиялық қосылыстар
негізінде
жасалады.
Олардың
құрамы
микроорганизмдердің қоректік заттарға деген
қажеттілігіне байланысты болады. Оларды
қарапайым
су
құбырында
ешқандай
қоспаларсыз дайындау мүмкін, себебі су
құрамында
олар
жеткілікті
мөлшерде
кездеседі. Егер де микроорганизмдердің
минералдық қор заттарға деген тұтыну
мөлшерін анықтау қажет болса, дайындау
жұмыстары дистилденген сумен жүргізіледі
және арнайы микроэлементтер енгізіледі.

14.

III. Тығыздығы бойынша:
1. Сұйық
2. Жартылай сұйық
3. Тығыз
IV. Қолданылуы бойынша:
1. Негізгі немесе универсальді (ЕПА, ЕПС)
2. Арнайы – микроорганизмдер қажет
ететін күрделі орта (Левенштейн-Йенсен)
3. Элективті (пептонды су, селениттік
орта, тұзды агар)
4. Дифференциалды-диагностикалық
(Гисс , Эндо, Левин, Плоскирев орталары)

15. Сұйық қоректік орта

• Құрамына 0,5%-ға дейін агар-агар қосылады.
• Алу көзі: Жалпы агар немесе агар-агар кейбір
қызыл
теңіз
балдырларынан алынатын полисахаридтер
қоспасы болып табылады.
• Қолдану мақсаты: Микроорганизмдер мен
бактерияларды өсіру үшін дақылдық орта
дайындауда қолданылады. Ең алғаш 1883
жылы Кохтың зертханасында тығыз қоректік
орта алу үшін агар қолданылған болатын.

16.

Жартылай сұйық орта құрамына 0,3-0,7%
агар қосылады.
Қатты қоректік орта құрамында 2% агар
немесе 12-15% желатин болады.
Құрамында органикалық қосындылары жоқ,
өте тығыз қоректік орталарды ығыстыру
үшін силикагель немесе кремнексиль гелі
қолданылады.
Көкөністердің
кесінді
бөліктері мен ұйып қалған қан – тығыз
қоректік ортаға мысал бола алады.

17. Қолданылуы бойынша

1. Негізгі немесе универсальді .
Бұл орталарда хемогетеротрофты, арнайы
органикалық заттарды қажет етпейтін
микроорганизмдердің көптеген түрлері
өседі. Бұл орталарға бактериялар жақсы
өсетін ет-пептонды сорпасы және ашытқы
саңырауқұлақтарға лайықты сусло жатады.

18. 2. Арнайы орта

Ерекше органикалық заттарды қажет ететін және
әмбебап ортада өспейтін хемоорганотрофты
микроорганизмдерді өсіретін орта.
Мысалы,
спирохеталарға
көмірсутегі
мен
аминқышқылдардан басқа, ұзын тізбекті майлы
қышқылдар қажет. Олар қан сарысуы құрамына
кіретіндіктен, спирохеталарға арналған қоректік
ортаға қан не қан сарысуын қосады. Ал кейбір
теңіздерде
тіршілік
ететін
бактериялар,
мысалы, Marinomonas туысына жататындар, теңіз
суына қажет етеді.

19. 3. Элективті немесе таңдамалы орта

• Бұл орта табиғи субстраттардан микроорганизмдердің жеке
топтарын бөліп алуға арналған. Оларды микробиологияға
С.И.Виноградский енгізді.
• Элективті деп микроорганизмдердің белгілі бір тобының
немесе түрінің өсуіне қажетті құрамы ерекше қоректік
орталарды айтады. Элективті ортаны жасау барысында
микроорганизмдердің физиологиясын және зат алмасуын,
олардың
қоректік
зат
көзіне
талғамын,
ортаның
қышқылдылығын, оттектік мөлшерін, температураны және
тағы басқа жағдайларды ескеру керек.
• Мысалы, азот қоспалары жоқ минералды ортада, жарық көзі
бар жағдайда, молекулярлы азот сіңіруші көк жасыл
балдырлар жақсы өседі. Осы ортаға қосымша органикалық
энергия көзін және көміртегі көзін қосып, қараңғы жағдайда
аэробты, азот сіңіруші Azotobacter-ді өсіріп алуға болады.

20. 4. Дифференциалды-диагностикалық орталар

Бұл орталарды жалпы микробиологияда әр түрлі
субстраттардан
бөліп
алынған
бактериялардың
физиологиялық-биохимиялық қасиеттерін анықтап, оларды
жіктеу үшін пайдаланады.
Ал медициналық және ветеринарлық микробиологияда
оларды ауруларды қоздыратын бактерияларды анықтау үшін
қолданады.
Бұл орталар бактериялардың белгілі бір ферменттерінің,
мысалы, каталаза, оксидаза, протеаза, фосфотаза,
желатиназа және гемолитикалық ферменттердің бар-жоғын
анықтау үшін қажет. Оған қоса, дифференциалдыдиагностикалық орталар бактериялардың энергия көзі ретінде
қандай заттарды қай жолмен пайдаланатынын анықтауға
мүмкіндік береді.

21. Қоректік орталарға қойылатын шарттар:

Бактерияның өсіп-өнуіне,қоректенуіне қажет
барлық қоректік заттар жеңіл қабылдайтындай
болу керек;
Тиісті орта қышқылдығы (рН);
Ылғалдылығы жоғары болуы керек;
Мүмкіндігінше мөлдір болуы керек;
Стерильді болуы керек ;
Өсу факторы болуы керек;
Изотониялық болу керек.

22. Таза дақыл түсінігі

Табиғи жағдайда микроорганизмдердің таза
дақылдары өте сирек кездеседі. Дегенмен, қазіргі
кезде бактериялардың қасиеттері туралы идеялар ,
сондай-ақ олардың өзара қарым-қатынастары
негізінде таза дақылдарды зерттеуге және оларды
бөліп алуға мүмкіндік ашылды. Сондықтан кезкелген ортадан әр түрлі бактериялардың таза
дақылдарын бөліп алу міндеттелген.
• Әдетте, бактериялардың таза дақылдарын бөліп
алуға
2-3 күн , бірақ (мысалы, туберкулез
бактериялар сияқты) кейбір микроорганимздер
үшін , бұл процесс 4-6 аптаға дейін кейінге
қалдырылуы мүмкін.

23.

• Таза дақыл – бір ғана жасушаның немесе
клонның ұрпағы деп сипаттама беруге
болады.Микроағзалардың таза дақылдарын
қатты қоректік ортаның бетінде немесе
өте сирек жағдайда орта ішінде бөліп
алады.
• Таза дақылдарды бөліп алу – бір ғана
жасушаны жасушалар популяциясынан
бөліп алудан басталады.

24. Таза дақылдарды бөліп алудың негізгі этаптары:

• I этап (нативті материал). Тығыз қоректік ортаға
егу (колония алу немесе жиынтықты дақылды алу).
• II этап (изолирленген колония). Колонияларды
бақылау, талдау
(бактерияның культуралдық
қасиеті).
Микроскопиялық
талдау
жүргізу
(морфологиялық ерекшеліктері ). Таза дақылға
арналған бояулы агарлы ортаға себу.
• III этап (таза дақыл). Бактерия культурасын
культуралық, морфологиялық,биохимиялық және
т.б. қасиеттері бойынша идентификациялау.

25. Сурет 2. Таза дақылдарды бөліп алу кезеңдері

Бояулы
агарлы
ортаға себу
Сурет 2. Таза дақылдарды бөліп алу кезеңдері

26. Жиынтықты дақыл

• Бір
түрге
жататын
немесе
бір
физиологиялық
топқа
жататын
микроорганизмдер өкілдері басым болса,
ондай дақыл жиынтықты дақыл деп
аталады.
• Жиынтықты
дақылдар
әдісін
микробиологиялық
зерттеулерге
С.Н.Виноградский
және М.Бейеринк
енгізген.

27.

• Жиынтықты дақылды алу элективті жағдайлар
жасауға негізделеді, яғни зерттеушіге қажетті
микроорганизмдердің
немесе
аралас
популяциядан
тұратын
микроорганизмдер
топтарының дамуын ғана қамтамасыз ететін
таңдамалы жағдайлар жасау.
• Элективті жағдай көбінесе сәйкес қоректік
орталарды таңдау арқылы жасалады, себебі әр
түрлі микроорганизмдердің дамуына қажет қорек
көздері де әр түрлі болып келеді. Мысалы,
автотрофты микроорганизмдердің жиынтықты
дақылдарын көміртегінің жалғыз көзі ретінде
көмірқышқылы болатын орталарда өсіру арқылы
алады.

28.

Себу кезінде бір-бірінен механикалық ажыратуға
негізделген таза дақылды бөліп алу әдістері:
Дригальский әдісі.
Ілмекпен себу (штрих бойынша).
Секторлы әдіспен себу.
Микроорганизмдердің биологиялық қасиеттеріне
негізделіп,таза дақылдарды бөліп алу әдісі:
Қозғалатын бактерияларды (Шукевич әдісіконденсацияланған суға себу).
Спора түзетін бактерияларды (зерттелетін материялды
қыздыру).
Қышқылға төзімді бактерияларды (зерттеу материялын
қышқылмен өңдеу).
Биологиялық әдіс арқылы патогенді бактерияларды
(жануарға жұқтыру).
Анаэробты бактерияларды.

29.

• Дригаль
әдісі.
Сабуро
және
Эндо,
Pseudomonas Isolation Agar, Bacillus cereus
Agar Base, ЕПА бар Петри табақшаларына
тұзақпен егу материалын жағамыз, содан
кейін стерильді шпателмен жаймалаймыз.
Келесі екінші табақшаны дәл осы шпателмен
қоректік орта бетін жаймалаймыз дәл осылай
тағы екі табақшаға жасаймыз (Сурет 3).

30.

Сурет 3. Дригаль әдісі негізінде өсіп
шыққан колониялар

31.

• «Штрих» әдісі - ілмек немесе тампон
арқылы қоректік ортаның барлық бетіне жиі
штрих жасау (сурет 4). Бұл әдіс сандық
анықтаусыз бөлектенген колонияларды алуға
көмектеседі.

32.

• Гоулди әдісі (сандық әдіс) 1 мл зерттелетін
материалдағы
тіршілікке
қабілетті
бактериалардың
санын
анықтауға
көмектеседі. Бактериалогиялық ілмектің
көмегі (d = 2 мм) арқылы зерттеу материалын
қатты қоректік ортаға I жағдай секторында
40
штрихқа
дейін
егеді.
Стерильді
бактериалогиялық ілмекпен I сектордан 4
штрих алынып II секторға егіледі; содан IIден III-ге, III-ден IV – ке егіледі.
I
және 1V сектор штрихтары ешқашан
қиылыспау керек (сурет 5). Бір тәуліктік
инкубациядан соң тіршілікке қабілетті
бактериаларды анықтайды.

33.

Сурет 5. Гоулди әдісі (сандық әдіс)

34.

• Кох әдісі – жалпы микрорганизмдерді
ауадан бөліп алуда, микрорганизмдердің
жалпы санын анықтауда және жабық,
стерильді
түрде,
лабораториялық
талаптарға сай өнімнің микрофлора
құрылымын құруға негізделген әдіс болып
есептеледі. Бұл әдіс түрлі субстраттардан
таза дақылдар бөліп алу және сандық
сипаттама үшін қолданады.

35. Әдіс кезеңдері:

өскен
колонияларды
санау
егу
сұйылтуды дайындау
бастапқы сұйылту

36. 1 саты. Бастапқы сұйылту

• Бастапқы сұйылту дегеніміз – зерттеуге
алынған шикізат көзінен 1мл мөлшерде
өнім алып, сұйылтуды жүргізу. Бастапқы
сұйылту - стерильді пипеткамен 1 мл
сұйықтықты үлгіні алып, оны 99 мл
стерильді құбыр суына құйылады. Сосын
оны 10-15 минут шайқағышқа қояды.

37. 2 саты. Сұйылтуды дайындау

• Жекеленген колониялар алу үшін микроорганизмдер бар
дақылды немесе материалды сұйылтады. Сұйылтуды
залалсыздандырылған құбыр суында, сұйылтудың тұрақты
коэффициентін пайдалана отырып дайындайды, әдетте бұл
коэффициент 10 санына тең. Сұйылту дайындау үшін
залалсыздандырылған
пробиркаларға
9
мл
залалсыздандырылған құбыр суын құяды. Зерттелетін
суспензиядан залалсыздандырылған пипеткамен 1 мл алып 9
мл залалсыздандырылған суға қосады – бұл бірінші сұйылту
(10-1). Алынған сұйылтуды жаңа залалсыздандырылған
пипеткамен жақсы араластырады да, осы пипеткамен 1 мл
суспензия алып келесі пробиркаға құяды. Бұл екінші сұйылту
(10-2). Осылайша келесі сұйылтулар дайындалады көрсетілген
(Сурет 6)

38.

Сурет 6. Сұйылтулар дайындау сызба нұсқасы

39.

40. 3 саты. Егу

• Петри табақшаларына 15-20 мл агарланған
ортаны құяды. Қатқан ортаға керек
сұйылтудан пипеткамен 0,1 мл суспензия
тамызып, шыны шпательмен (Дригальский
шпателі) жаяды. Егуден кейін Петри
табақшаларын термостатқа қояды.

41. 4 саты. Өскен колонияларды санау

• Петри табақшасында өскен колониялардың санын
дақылдаудың бір тәулігінен кейін санайды.
Табақшадағы колониялардың орташа санын
анықтайды да формула бойынша 1 мл-дегі
клеткалар санын есептейді: (1)
М=а*10n/v
(1)
• мұндағы, М – 1 мл-дегі
клеткаларының саны; а – Петри
микроорганизмдер колониясының
– сұйытылу коэффициенті; n –
сұйылтудың реттік саны; v –
суспензияның көлемі.
микроорганизм
табақшасындағы
орташа саны; 10
егу жүргізілген
егуге алынған

42.

"Газон" әдісін
дезинфектанттарға,
бактериофагтарға,
антибиотиктерге
сезімталдықты
анықтауда,
бактериялардың жаппай өсуін алу үшін
қолданады.
1 мл тәуліктік 1 млрд. зерттелетін таза
дақыл сорпасын ілмек арқылы қоректік
ортаның барлық бетіне жаяды.

43. Колонияларға сипаттама беру

44.

Микроорганизмдер колониясы және олардың
түрлері
1 - қоректік орта
бетінде
дөңес
колониялар ;
2 – колониялар
құрылымы;
3 – колонияның
шеті ;
4 – колонияның
ішкі құрылымы.

45.

Колония формалары

46. Колония профилі

а – иілген;
б – кратертәрізді;
в – бугристі;
г – агарға ене орналасқан;
д – жалпақ;
е –дөңес ;
ж – тамшы тәрізді;
з - конустәрізді

47. Колония жиегі

а – тегіс;
б – толқынды;
в – тісті;
г – үшкір;
д – дұрыс емес (неправильный);
е – кірпікшелі;
ж – жіп тәрізді ;
з – талшықты;
и - бұтақталған

48. Дақылдандыру көріністері:

I.
II.
Сұйық ортада өсуі:
- табиғи тұнба түрінде (қауыз тәріздес, ұнтақ,
мақта кесегі түрінде);
-беткей үлбір түрінде (жіңішке, жұмсақ,
қабыршақты-сүйелді,);
- диффузды бірқалыпты лайлану түрінде
Тығыз ортада өсуі - әртүрлі колония түзу (тығыз,
шырышты, қаймақ тәріздес), өлшемдері (нүктелі 1 мм дейін, ұсақ – 1-2 мм, орташа – 2-4 мм, ірі – 4
мм жоғары), түсі (сары, көк, қызыл, қара), иісі,
пішіндері (домалық, сопақша, бұтақша).
- S-типті – колония шеті тегіс, жұмсақ, жылтыр,
томпақ;
- R-типті – колония шеті дұрыс емес, бұдырлау.

49. Анаэробтарды дақылдандыру тәсілдері:

• Жартылай сұйық ағар құйылған пробиркаға жоғарыдан түбіне
дейін себу әдісімен.
• Анаэростатта өсіру – саңылауы жоқ жабық ыдыстарда:
- механикалық әдіс бойынша ауаны, вакуумдық насос арқылы
шығару;
- химиялық әдіс «пирогаллолмен», «ГазПак»;
- ауаның инертті газбен (азот) алмасуы немесе оттексіз газдың
қоспасымен (N2-85%, CO2-10%,H2-5%).
• Биологиялық (Фортнер әдісі) – аэроб пен анаэробтарды бірге
өсіру.
• Веньяль-Вейон әдісі – қантты агары бар пробиркаға пипеткамен
балқытылған агарға себу.
• Комбинациялық әдіс –оттегіні өзіне адсорбциялайтын және
сіңіретін ішкі органдардың бөліктері бар ортаны қолдану.

50.

Анаэробтарды дақылдандыруға
арналған қоректік орталар:
Китт-Тароцци
Вильсон-Блер
Стерильдікті бақылау ортасы
Блаурок

51.

Анаэробтық жағдай жасау әдістері:
• Физикалық (ауаны механикалық жолмен жою);
• Химиялық (пирогаллол,тиогликольдық қышқыл,
натрии гидросульфат заттарымен оттегіні жұту);
• Биологиялық (Пастер әдісі-анаэробтар мен
аэробтарды бірге өсіру);
• Арнайы орталарды қолдану (Китт-Тароцци,
Вильсон-Блер, СКС және т.б).

52.

Диагностиканың бактериологиялық
(вирусологиялық) әдіс кезеңдері:
микроорганизмдердің таза дақылдарын бөліп алу,
микроорганизмдердің таза дақылдарын
идентификациялау.
Бактериялардың таза дақылдарын бөліп алу
принциптері:
себу кезінде микроорганизмдерді механикалық
ажырату,
микроорганизмдердің биологиялық қасиеттерін
қолдану.

53.

Микроорганизмдерді
дақылдандыруды тәжірибеде
қолдану:
• жұқпалық ауруларға диагноз қою үшін
бактериологиялық (вирусологиялық)
әдісті қолдану,
• Биотехнологиялық жұмыстар атқару
үшін.

54.

НАЗАР АУДАРЫП
ТЫҢДАҒАНДАРЫҢЫЗҒА
РАХМЕТ!