Культивирование и выделение чистых культур анаэробов

1. Культивирование и выделение чистых культур анаэробов

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И
ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ
КУЛЬТУР АНАЭРОБОВ

2. Рост и размножение МО

РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ МО

3. Рост МО на жидких средах

РОСТ МО НА ЖИДКИХ СРЕДАХ
1, 4 – пленочный рост
2 – придонный рост
3 – пристеночный рост
5 – диффузный рост

4. Рост МО на полужидких средах

РОСТ МО НА ПОЛУЖИДКИХ
СРЕДАХ
Рост в виде воронки, чулка, сталактита, гвоздя…

5. Рост МО на плотных питательных средах

РОСТ МО НА ПЛОТНЫХ
ПИТАТЕЛЬНЫХ
СРЕДАХ
Колония – видимое,
изолированное скопление МО,
образующееся в результате
размножения одной материнской
клетки-предшественницы на
плотной питательной среде.
Чистая культура – популяция
бактерий одного вида или одной
разновидности, выращенная на
питательной среде

6.

7. Выделение чистой культуры

ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ
1. Получение изолированных колоний из исследуемого материала
Готовят мазок, окрашивают его по Граму, микроскопируют. Если бактерий
много, то исследуемый материал разводят в пробирке со стериальным
изотоническим раствором NaCl. Исследуемый материал засевают в чашку
Петри на плотную питательную среду и помещают в термостат (37 град.) на 1824 ч.

8.

2. Пересев материала с целью накопления чистой культуры
На этом этапе изучают культуральные свойства бактерий. Для этого
просматривают чашки и изучают изолированные колонии, обращая внимание
на их форму, величину, консистенцию и другие признаки. Для определения
морфологии клеток и их тинкториальных свойств готовят мазок, окрашивают по
Граму и микроскопируют.

9.

3. Идентификация чистой культуры
Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Чистая культура
характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании
окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нем обнаруживаются
морфологические и тинкториальные однородные клетки.

10. К основным видовым признакам бактерий относятся:

К ОСНОВНЫМ ВИДОВЫМ
ПРИЗНАКАМ БАКТЕРИЙ ОТНОСЯТСЯ:
Морфология микробной клетки;
Тинкториальные свойства – особенности окрашивания с помощью простых и
сложных методов окраски;
Культуральные признаки – особенности роста МО на питательных средах;
Биохимические признаки – наличие у бактерий ферментов, необходимых для
синтеза или расщепления различных химических соединений.

11. К дополнительным признакам, используемым при идентификации бактерий отностятся:

К ДОПОЛНИТЕЛЬНЫМ ПРИЗНАКАМ,
ИСПОЛЬЗУЕМЫМ ПРИ
ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ
ОТНОСТЯТСЯ:
Наличие видоспецифических АГ;
Чувствительность в видоспецифическим бактериофагам;
Видовая резистентность к определенным АБ;
Для патогенных бактерий – продукция определенных факторов вирулентности.

12. Создание анаэробных условий

СОЗДАНИЕ АНАЭРОБНЫХ
УСЛОВИЙ
Учитывая, что свободный молекулярный кислород является токсичным для
облигатно-анаэробных бактерий, обязательным условием культивирования
таких микроорганизмов является ограничение его доступа. Существует ряд
методов (механических, физических, биологических), которые позволяют это
обеспечить.

13. Физические методы

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Для удаления растворенного в питательных
средах кислорода используют их регенерацию
путем кипячения в течение 15-20 минут на
водяной бане с последующим быстрым
охлаждением до 50 градусов. После посева
поверхность среды заливают парафином или
вазелиновым маслом. Так же, возможен посев в
столбик плотной или полужидкой среды на
глубину 10-12см. кислород с воздуха
диффундирует на 1,5-2см, а в глубине создаются
благоприятные условия.
Применение анаэростатов и анаэробных боксов.

14. Химические методы

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Для поглощения кислорода из замкнутого пространства
можно использовать гидросульфит натрия. Для
связывания кислорода в 1л объема используют 100мл
свежеприготовленного 20% Na2S2O4 и 16мл 50% КОН.
Для связывания остатков кислорода используют
вещества-редуценты, к которым относится
тиогликолевая кислота или тиогликолят натрия,
аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и
цистеин, муравьинокислый натрий и т.д.

15. Биологические методы

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Совместно выращивание анаэробов и аэробов
(метод Фортнера). При нем на одну половину
чашку засевают исследуемый материал, а на
другую – культуру аэробного или факультативноанаэробного микроба, способного энергично
поглощать кислород.
Помещают в среду кусочки печени, почек, мозга.
При этом тканевые клетки активно поглощают и
адсорбируют кислород, а в среде создаются
анаэробные условия.

16. Методы выделения чистых культур анаэробов

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ
КУЛЬТУР АНАЭРОБОВ
Метод Цейсслера. Исследуемый материал сеют штрихами по поверхности плотной
среды. Создают анаэробные условия. И инкубируют при 37 градусах 24-72ч.
Изолированные колонии анаэробов пересевают на среду контроля стерильности или
среду Китта-Тароцци.
Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 45мл изотонического раствора. Перемешивают запаянным капилляром переносят в
пробирку с охлажденным до 45-50 градусов сахарным агаром, разлитым высоким
столбиком. После перемешивания этим же капилляром засевают еще две пробирки с
сахарным агаром и быстро охлаждают под струей воды. Выросшие в глубине колонии
пересевают на СКС или среду Китта-Тароцци.
Метод Перетца. Готовят разведение материала, как указано выше. Содержимое
пробирки с соответствующим разведением выливают в чашку Петри, на дне которой
на двух палочках лежит стеклянная пластина 6х6см. среду заливают так, что бы она
заполнила пространство между пластиной и дном чашки. При появлении роста
пластинку поднимают и чистые колонии пересевают.