Роль внеклеточного рН в регуляции Са2+-входа в лимфоцитах человека

1.

Санкт-Петербургский Политехнический Университет Петра Великого
Институт физики, нанотехнологий и телекоммуникаций
Кафедра биофизики
ВЫПУСКНАЯ РАБОТА МАГИСТРА:
Роль внеклеточного рН в регуляции Са2+-входа
в лимфоцитах человека
Работа выполнена в ИНЦ РАН в лаборатории
Ионных механизмов клеточной сигнализации
Выполнила: студентка гр.63417/1 Черезова А.Л.
Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. Семенова С.Б.
Санкт-Петербург 2016

2.

Кальциевые каналы в Т-клетках

3.

Филогенетическое древо суперсемейства каналов TRP
млекопитающих

4.

Схема трансклеточного транспорта в почке и тонком кишечнике

5.

Цель работы: Исследовать роль внеклеточного рН в регуляции
активности кальциевых каналов в Т-клетках линии Jurkat.
Задачи:
1.C помощью метода patch-clamp исследовать влияние изменения
внеклеточного рН на активность кальциевых каналов TRPV5/TRPV6
в плазматической мембране клеток Jurkat.
2.С помощью флуоресцентного кальциевого зонда Fura-2AM
исследовать роль внеклеточного рН в регуляции внутриклеточной
концентрации Са2+.
3.Исследовать роль внутриклеточного транспорта в регуляции
активности каналов TRPV5/TRPV6 в клетках Jurkat.
4.Определить роль внутриклеточного транспорта в регуляции
внутриклеточной концентрации Са2+.

6.

Методы:
Метод локальной фиксации потенциала, patch-clamp
Метод флуоресцентного измерения внутриклеточной концентрации
Са2+

7.

Развитие интегральной активности каналов TRPV5/V6 в клетках Jurkat
Развитие активности каналов после образования whole-cell конфигурации.
Поддерживаемый мембранный потенциал -70мВ.

8.

Изменение активности каналов TRPV5/V6 при понижении рН
наружного раствора
А. Запись интегрального тока в режиме whole-cell. Уменьшение активности каналов
при смене наружного раствора с рН=7,3 на раствор с рН=6. Поддерживаемый
потенциал -70мВ. Б. Соответствующие различным рН амплитудные гистограммы,
описанные функцией Гаусса.

9.

Изменение активности каналов TRPV5/V6 при повышении рН
наружного раствора
А. Запись интегрального тока в режиме whole-cell. Увеличение активности каналов
при смене наружного раствора с рН=7,3 на раствор с рН=8,2. Поддерживаемый
потенциал -70 мВ. Б. Амплитудные гистограммы токов, описанные функцией
Гаусса.

10.

Влияние снижения рН раствора на активность каналов TRPV5/V6
в клетках Jurkat
Записи токов в режиме outside-out. Понижение рН раствора приводило к
инактивации каналов. Этот эффект был необратим. Поддерживаемый
потенциал -70мВ.

11.

Действие рН на активность одиночных каналов TRPV5/V6
в клетках Jurkat
Записи токов одиночных каналов в конфигурации сell-attached. Замена
экстраклеточного раствора с рН=7,3 на раствор с рН=6,0 (при нейтральном рН раствора
в пипетке) приводила к инактивации каналов TRPV5/V6. Поддерживаемый потенциал
на мембране -70мВ.

12.

Влияние ингибитора внутриклеточного транспорта, дайносора, на
активность TRPV5/V6
Запись интегрального тока в режиме whole-cell.
Уменьшение активности каналов после подачи 100мкМ дайносора.

13.

Влияние внеклеточного рН на уровень внутриклеточного кальция
в клетках Jurkat
А. Измерения уровня внутриклеточной концентрации Са2+ с использованием Са2+чувствительного зонда Fura-2АМ. Ацидификация наружного раствора приводила к
уменьшению входа кальция в клетки Jurkat, защелачивание наружного раствора
приводило к существенному увеличению входа кальция в клетки Jurkat.
Б. Гистограммы изменения концентрации внутриклеточного кальция при рН=7,3,
рН=6, рН=8,2. *P<0,05 согласно t-тесту Стьюдента.

14.

Влияние дайносора на уровень внутриклеточного кальция
в клетках Jurkat
А. Ингибитор эндо/экзоцитоза дайносор (100мкМ) блокирует вход Са 2+ в клетки.
Б. Гистограммы изменения концентрации внутриклеточного кальция с дайносором и
без. *P<0,05 согласно t-тесту Стьюдента.

15.

Предполагаемая схема регуляции кальциевого входа
в Т-лимфоцитах человека
Изменение внеклеточного рН
Активация внутриклеточного транспорта и
доставка каналов TRPV5/V6 на плазматическую
мембрану клеток
Са2+-вход через каналы TRPV5/V6 в Т-клетки
человека
Изменение концентрации внутриклеточного Са2+
Иммунный ответ Т-клеток

16.

Выводы:
1) Активность каналов TRPV5/V6 в клетках Jurkat зависит от
внеклеточного рН. Повышение рН увеличивает активность каналов,
снижение рН уменьшает активность каналов.
2) Регуляция активности каналов внеклеточным рН, по-видимому, не
связана с прямым воздействием на пору каналов TRPV5/V6.
3) Ингибитор динамин-зависимого эндоцитоза, дайносор блокирует
активность каналов TRPV5/V6.
4) Вход кальция в клетки Jurkat регулируется внеклеточным рН.
Повышение рН увеличивает уровень свободного Са2+, снижение рН
уменьшает уровень свободного Са2+ в клетке.
5)Блокирование внутриклеточного транспорта ингибирует вход Са2+ в
клетки Jurkat.
6) Внеклеточный рН участвует в регуляции активности каналов
TRPV5/V6 и входе Са2+ в Т-клетки Jurkat, возможно, через воздействие
на внутриклеточный транспорт.

17.

1) Тезисы докладов и сообщений, представленных на
II Всероссийскую конференцию "Внутриклеточная сигнализация,
транспорт, цитоскелет". (Санкт-Петербург, 20-22 октября 2015г.)
Роль внеклеточного рН в регуляции кальциевого входа в клетках
Jurkat. А.Л. Черезова, В.Н. Томилин, Ю.А. Негуляев,
С.Б. Семёнова. ЦИТОЛОГИЯ 2015, Том 57, №9, стр.663.
2) Научная публикация в зарубежном рецензируемом журнале.
TRPV5/V6 Channels Mediate Ca2+ Influx in Jurkat T Cells Under the
Control of Extracellular pH. Victor N. Tomilin, Alena L. Cherezova, Yuri
A. Negulyaev and Svetlana B. Semenova. Journal of Cellular
Biochemistry, 2016. 117(1):197–206.