Биотехнология в животноводстве

1.

4. ВВЕДЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИЮ
Раздел 3. Биотехнология в народном
хозяйстве
Тема 2. Биотехнология в животноводстве

2.

Биотехнология в
животноводстве

3.

22 февраля 1997 года мир узнал о существовании овечки
Долли — первого теплокровного животного, клонированного с
помощью обычной соматической клетки.
В век быстро развивающихся технологий вопрос
клонирования — воспроизведения генетически идентичных
родительскому организму особей — становится по-настоящему
острым и дискуссионным. Но говорить о клонировании как о
чём-то принципиально новом и противоестественном неверно. В
природе размножение через воспроизведение генетически
идентичных особей — явление весьма распространённое.
Бактерии просто делятся надвое, грибы, водоросли и некоторые
другие организмы размножаются спорами, а некоторые
насекомые и даже позвоночные могут развиваться без участия
мужских половых клеток, только при помощи женских. Во всех
перечисленных случаях дочерний организм является клоном
родительского. Не обошёл процесс естественного клонирования
и человека: однояйцевые близнецы обладают абсолютно
одинаковыми наборами генов.

4.

Учёные
задумали
самостоятельно
воспроизвести этот процесс. Разумеется, речь
шла не о создании армии клонов, а о
выращивании
животных
и
растений
с
определёнными полезными качествами. Сельское
хозяйство, лёгкая промышленность, медицина
развивались бы быстрее, если бы клонирование
было поставлено на поток. Растения и сами
прекрасно воспроизводят свои копии, человеку
остаётся только контролировать процесс, а вот
вопрос с точным воспроизведением животных
долгое время оставался весьма проблемным.

5.

Ответ на него был найден ближе к середине
прошлого
века.
Учёные
решили,
что
для
клонирования нужно взять зиготу (оплодотворённую
яйцеклетку) одного животного, удалить из неё
генетический
материал
и
вставить
ядро
соматической
(не
половой)
клетки
другого
животного. При естественном половом размножении
дочерний организм получает одинарный набор генов
от половой клетки отца и такой же — от
яйцеклетки. Клон в момент своего создания тоже
получает двойной набор генов, но только от одного
родителя. Правда, полной генетической копией
получившийся организм всё-таки не будет: в каждом
геноме есть определённое количество случайных
мутаций, которые не совпадают даже у клонов.

6.

Но мутации — это не главная проблема, с
которой столкнулись учёные в середине XX века.
Дело в том, что соматической является любая
клетка тела, кроме половой, а любая клетка тела
имеет свою дифференциацию. Иными словами, в
каждой клетке работают только те гены, которые
нужны
ей
для
выполнения
«служебных
обязанностей»,
различных
у
каждого
органа.
Исследователи боялись, что, пересадив в зиготу
такой специализированный генетический материал,
они создадут нежизнеспособный клон. Эти сомнения
развеял Джон Гёрдон, после того как в 1962 году
смог клонировать лягушку описанным способом.

7.

Правда, некоторые учёные посчитали
опыт не совсем чистым, потому что
Гёрдон использовал клетки головастиков.
Через восемь лет, в 1970 году, ему
удалось повторить тот же эксперимент, но
уже с клетками взрослых особей. Клоны
выжили. Таким образом, учёные сделали
определяющее в области клонирования
открытие: специализированные
соматические клетки могут дать жизнь
новому организму.

8.

Так был открыт путь клонированию
млекопитающих. Однако здесь всё пошло
совсем не так гладко: долгие годы
исследователи разных стран не могли
повторить опыт Гёрдона на более сложных
животных. Тогда они решили упростить
себе задачу: в зиготу помещали не ядро
соматической клетки, а клетку эмбриона.
Успеха здесь добились учёные из двух
стран: советские генетики создали мышь
Машу, а британские — овец Меган и
Мораг.

9.

Так почему не получалось создать клон
с помощью соматических клеток? После
первых неудавшихся опытов учёные решили,
что
провести
такой
эксперимент
с
млекопитающими просто невозможно, это
мнение царило в научном мире практически
до конца XX века. А потом в Рослинском
университете
(Великобритания)
появилась
Долли — первое млекопитающее, полученное
в
результате
слияния
яйцеклетки
и
специализированной соматической клетки.
Что же группа Яна Вилмута изменила в
опыте, чтобы Долли смогла появиться на
свет?

10.

Исследователи совсем немного поменяли
технологию: вместо зиготы они использовали
неоплодотворённую яйцеклетку.
Но даже эти перемены не привели группу к
абсолютному успеху. Долли появилась из одной из
277 яйцеклеток; 28 её близнецов успели развиться
до состояния эмбрионов, а родилась только она.
Вряд ли такую технологию можно назвать успешной
и ставить на поток, но в конце 1990-х не это
занимало умы учёных. Главным было доказать, что
млекопитающих можно клонировать с помощью
соматической клетки. С этой точки зрения появление
Долли стало грандиозным успехом.

11.

Овечка родилась 5 июля 1996 года под
именем (точнее, номером) 6LL3. Идея дать первому
млекопитающему-клону имя Долли пришла в
голову
фермерам,
которые
приглядывали
за
суррогатной матерью овцы (её настоящая мать
умерла тремя годами ранее; использованный
генетический материал был заморожен и заботливо
сохранён до лучших времён).
Им показалось забавным то, что 6LL3
появилась из клетки, взятой из вымени, поэтому они
дали родившейся овце имя кантри-певицы Долли
Партон, которая своей славой отчасти была обязана
крупному бюсту.

12.

Овца прожила шесть лет и родила
шестерых ягнят. Правда, шесть лет — это
маловато для овец, которые, как правило,
умирают в возрасте 10—12 лет, но по
официальной версии смерть Долли с
последствиями клонирования никак не
связана: два года овца страдала от
артрита, а в конце жизни ещё и
подхватила тяжёлый лёгочный вирус. 14
февраля 2003 года одно из самых
знаменитых животных усыпили.

13.

Но известной Долли стала не сразу: мир
узнал о её существовании лишь спустя семь
месяцев после её рождения, 22 февраля 1997
года. Всё это время учёные получали патент
на методику переноса ядра, поэтому не могли
объявить о своём невероятном успехе в
прессе. А сёстры-близнецы у Долли всё-таки
появились. На 2016 год 13 из них уже
достигли солидного возраста в семь — девять
лет.
Технология,
которая
сначала
не
отличалась высокой результативностью, была
доработана,
что
позволило
проводить
эксперименты
и
на
других
домашних
животных.

14.

Одна из основных целей, которую преследуют
сейчас учёные, — это «возрождение» вымерших
видов. Первопроходцами в этой области стали
испанские исследователи: в 2009 году они
клонировали пиренейскую козу, исчезнувшую с лица
земли девятью годами ранее. Учёным повезло: в
Исследовательском центре сельского хозяйства и
технологий
Арагона
сохранился
генетический
материал животного, который и использовался при
клонировании.
Успех
овечки
Долли,
однако,
повторить не получилось: клон погиб через 7 минут
после рождения из-за врождённого дефекта лёгких.

15.

Многие учёные считают, что говорить о
клонировании вымерших видов пока рано. Вопервых, даже если получится выделить ДНК
исчезнувшего животного из останков, неясно, что
делать с яйцеклеткой. Группа из Оксфорда пытается
решить эту проблему с помощью яйцеклетки
родственного вида. Исследователи работают над
воскрешением птицы Додо, исчезнувшей ещё в конце
XVII
века.
Они
выяснили,
что
ближайшим
родственником этой большой нелетавшей птицы
является голубь. Состоятельность оксфордовской
теории только предстоит выяснить.

16.

Во-вторых, непонятно, как вымершие
организмы отреагируют на изменившиеся
условия окружающей среды. Скептики
считают, что организмы клонов не смогут
адаптироваться даже к современному
составу атмосферы и погибнут.

17.

Но подобные опасения не должны И
НЕ МОГУТ остановить учёных. Научное
сообщество не может сказать наверняка,
как
специализированные
соматические
клетки становятся клетками, дающими
жизнь, или почему в клонировании нужно
использовать яйцеклетку, а не зиготу.
Предугадывать
реакцию
природы
на
воспроизведение
вымерших
видов
—
занятие неблагодарное. Ни одно сомнение
не стоит того, чтобы отказаться от
попыток.

18. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Технология
трансплантации
эмбрионов.
Трансплантация
эмбрионов
сельскохозяйственных
животных – биотехнологический метод воспроизводства,
позволяющий увеличить темпы воспроизводства и повысить эффективность племенной работы. Наиболее
приемлемы для трансплантации эмбрионов малоплодные
виды животных: коровы, лошади, овцы. В мировой практике
животноводства метод трансплантации эмбрионов в
большей степени применяется в молочном и мясном
скотоводстве. Используя реципиентов для пересадки
эмбрионов, полученных от одной отобранной коровы–
донора, можно увеличить число ее потомков в десятки и
сотни раз. Теоретически от генетически выдающейся
коровы–донора за всю ее жизнь можно получить не менее
500 телят.
18

19. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

В трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота
сделан огромный прогресс, вследствие чего этот метод занял
прочное место в современных программах селекции. Метод
трансплантации
вместе
с
искусственным
осеменением
рассматривается
как
основа
современной
биотехнологии
воспроизводства высокопродуктивных племенных животных.
Технология трансплантации эмбрионов включает ряд
последовательных этапов:
- отбор доноров;
- проведение суперовуляции у доноров;
- отбор производителей и осеменение доноров;
- извлечение эмбрионов и их оценка;
- культивирование или замораживание эмбрионов;
- отбор и подготовку реципиентов;
- пересадку эмбрионов реципиентам;
- оценку результатов трансплантации.
19

20. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Отбор доноров. В селекционных программах отбору
доноров придается огромное значение. Наиболее важным
критерием на первых этапах отбора коров доноров служит их
высокая племенная ценность, то есть способность передавать
гены высокой продуктивности своим потомкам. В большинстве
случаев в качестве коров доноров отбирают матерей потенциальных племенных быков. Племенная ценность донора
должна подтверждаться не только высокой продуктивностью
самой коровы, но и ее родственников. Отбор доноров
производится в племенных хозяйствах, главным образом, в
племенных заводах, имеющих высокий уровень молочной
продуктивности. В группу доноров, отобранных в качестве
матерей быков, включают лучших коров племенных стад. Поэтому
селекционный дифференциал, являющийся одним из главных
показателей расчета ожидаемого генетического эффекта селекции,
будет всегда высоким.
.
20

21. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Сначала племенную ценность коровы – донора определяют по ее
собственному фенотипу. Например, по таким экономически важным
признакам, как молочная продуктивность, качество молока и так
далее. Наряду с молочной продуктивностью для отбора доноров в
зависимости от породы устанавливают минимальные требования по
другим селекционным признакам, таким, как содержание жира и
белка в молоке, пригодность коров к машинному доению, крепость
конституции и экстерьер.
Предпочтение следует отдавать коровам, сохранившим в течение трех
отелов стабильную воспроизводительную способность. Как
показывают исследования, из-за плохой воспроизводительной
функции до 50% коров с высокой племенной ценностью непригодны
для воспроизводства полноценных эмбрионов. Потенциальные
коровы–доноры с хорошими и устойчивыми воспроизводительными
способностями
отличаются
предрасположенностью
к
воспроизводству эмбрионов, которые можно регулярно получать
через каждые 2 месяца.
21

22. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Большинство исследователей считает, что интегральным
показателем воспроизводительной способности коров является
межотельный период (МОП). Если исходить из общепринятого
положения, что от коровы нужно получить одного теленка в год, то
МОП в среднем не должен превышать 365 дней. МОП включает два
показателя– сервис–период и период стельности. Сервис – период
более
точно
выявляет
потенциальные
возможности
воспроизводительной функции коров. Он тесно связан с МОП (r =
0,9).
Если
исходить
из
того,
что
продолжительность
эмбрионального периода у коров в среднем составляет 285 дней,
то, следовательно, оптимальный сервис – период не должен
превышать 90 дней. В этот период корова должна быть
оплодотворена. Такой оптимальный биологически оправданный
сервис– период позволяет получать от коровы по одному теленку
в год.
.
22

23. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Сервис – период в основном зависит от интервала между
отелом и первым осеменением и интервала между первым и
последним. Период от отела до первого осеменения определяется
биологическими и хозяйственными факторами. С биологической точки
зрения этот период зависит главным образом от инволюции матки и
выраженности у коров половой охоты. Срок завершения инволюции
матки колеблется в пределах 26-52 дней. В то же время первая
овуляция у молочных коров наступает значительно раньше – с 10-х
суток после отела. При хороших условиях кормления и правильной
технологии содержания гинекологически здоровых коров можно
осеменять в первый месяц после нормального отела. Однако,
высокопродуктивных коров целесообразно осеменять на втором
месяце. Это обусловлено тем, что первый половой цикл проявляется
слабо, половая охота клинически плохо определяется или вовсе
необнаруживается.
23

24. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Первое осеменение коров на втором месяце после отела не
удлиняет сервис – и межотельный периоды. При оптимальном сервис–
периоде до 80 дней после первого и второго осеменений средняя
оплодотворяемость коров составляет 95-98%, а продолжительность МОП
не превышает 365 дней.
Для
оценки
воспроизводительной
способности
коров,
отобранных
в
качестве
потенциальных
доноров,
необходимо
анализировать такие параметры, как оплодотворяемость от первого
осеменения и индекс осеменения. При правильной технике осеменения и
своевременном определении половой охоты оплодотворяемость коров от
первого осеменения должна составлять в среднем 60%. Важным
показателем воспроизводительной способности коров является индекс
осеменения, то есть количество осеменений на одно оплодотворение.
Низкая оплодотворяемость коров от первого осеменения и высокий
индекс осеменения указывают на плохую воспроизводительную
способность коров. Индекс осеменения коров, выделяемых в группу
потенциальных доноров, не должен превышать 1.5. В идеальном случае
потенциальная корова– донор должна иметь индекс осеменения, равный
1. Укоров доноров при всех отелах должны отсутствовать осложнения
(мертворождаемость, задержания последа, послеродо- вые заболевания
половых органов).

25. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Проведение суперовуляции у доноров.
При суперовуляции
(множественная) выходит большее количество яйцеклеток, чем при
обычной.
Суперовуляцию проводят у одноплодных животных с целью
увеличения количества получаемых эмбрионов. Для увеличения
количества созревающих фолликулов у самок сельскохозяйственных
животных
используют
фолликулостимулирующие
гормоны
(простагландины, эстрофан, эструмат, матазин и др.). Метод разработан
М.М.Завадовским. Он установил, что при введении СЖК (сыворотки
жеребых кобыл) у самок возрастает количество созревающих
фолликулов. Степень суперовуляции зависит от дозы СЖК –
гормонального препарата, представляющего нормальную стерильную
сыворотку кобыл, полученную в период от 40 до 100 дней жеребости.
Главный недостаток СЖК – сильная антигенность, возможна резко
выраженная аллергическая реакция. Выпускают препараты СЖК высокой
степени очистки (фоллигон,интергонан,малотропин).
25

26. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Гипофизарный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ)
получают из гипофизов сельскохозяйственных животных.
Основное действие ФСГ – стимуляция множественного роста
фолликулов. ФСГ из гипофиза овец содержит примесь
лютеинизирующего гормона (ЛГ) до 0,6 ед. мг, из гипофиза
лошадей– 0,16 ед./мг. Овуляция происходит при совместном
действии ФСГ иЛГ. Оптимальная доза ФСГ для гормональной
обработки доноров– 32-50 мг. В экстрактах гипофиза содержится
несколько гетерогенных форм ЛГ, которые влияют на развитие
фолликулов, секрецию эстрогенов, формирование желтого тела,
продуцирование им прогестерона. При гормональной обработке
коров– доноров ЛГ используют вместе с ФСГ в объеме 20% общей
дозы ФСГ.
.
26

27. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Гонадотропин – рилизинг гормон образуется в передней доле
гипоталамуса, вызывает выделение ФСГ и ЛГ из гипофиза. Технология
трансплантации эмбрионов предусматривает применение гормона прогестерона и антисыворотки СЖК. Прогестерон стимулируется желтым
телом и активизирует процессы в матке для сохранения беременности.
Антисыворотка СЖК применяется для сокращения действия СЖК при
гормональной обработке доноров. Действие СЖК длитсяоколо 50-60дней, что снижает качество получаемых эмбрионов. Антисыворотку СЖК
получают методом иммунизации овец, коз, кроликов очищенной СЖК.
Наиболее активная сыворотка получается при иммунизации коз.
Коровы – доноры поразному реагируют на гормональную обработку.
Принято всех коров– доноров разделять на три группы: хорошо реагирующие, удовлетворительно реагирующие, практически не реагирующие.
27

28. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Суперовуляторные качества доноров можно оценить по
первой гормональной обработке, вероятность оценки составляет
0,6-0,8. При отборе доноров непосредственно в хозяйстве
необходимо первую гормональную обработку провести на месте и
только по полученным данным решать вопрос о переводе
животных в группу доноров. Достоверные суперовуляторные
качества доноров точно оценить можно только на основании
многократных гормональныхобработок.
На суперовуляторную реакцию доноров существенное
влияние оказывают: качество гормона, его доза, стадия лактации,
характер течения предшествующих родов и послеродового
периода, продуктивность, сезон, порода. Положительную реакцию
можно ожидать, когда к моменту гормональной обработки в
яичниках коровы функционирует желтое тело диаметром 1,5 см.
.
28

29. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Наибольшее распространение для суперовуляции у коров
получили гормоны СЖК с простагландинами. Оптимальной
считается доза СЖК (интергонан, малотропин, фоллигон и др.)
2500-3000МЕ. При такой дозе получают до девяти овуляций.
Эффективно введения СЖКмежду 10-ми –12-ми сутками
эстрального цикла и через 48 ч - простаглан- дина, вызывающего
регрессию желтого тела, половую охоту и овуляцию. Через 48 ч
после введения простагландина у 95% коров – доноров происходит полиовуляция. Овулируют в среднем 10 яйцеклеток. Их
оплодотво- ряемость достигает 80% и более. Возможно
применение аналогов про- стагландина-эстрофана, фоллигона и
др. Хороший эффект достигается при введении ФСГ, выделяемого
передней долей гипофиза. Гормон ФСГв комбинации с ЛГвводят в
соотношении 5:1 многократно. Доза ФСГ3250 мг на донора.
Многократная обработка гормоном ФСГс интервалом в 45-60 дней
не снижает суперовуляторные качества коров-доноров. Одна- ко,
некоторые коровы (3-5%) характеризуются отрицательной
реакцией к многократной гормональной обработке.
29

30. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Установлено, что от доноров в течение года можно получать
эмбрионы пять раз с интервалами в 45-65 дней при вымывании в
среднем по 5-6 эмбрионов за один цикл. Однако при обработке СЖК при
повторных вымываниях процент оплодотворяемости яйцеклеток
снижается почти в два раза. При обработке СЖК часто образуются кисты
яичников.
Эффективность суперовуляции в последующем определяется
эффективностью искусственного осеменения коров– доноров. При этом
только 60-65% получаемых эмбрионов пригодны для пересадки
реципиентам.
Остальные
35-40%
составляют
яйцеклетки
или
дегенерированные
эмбрионы.
Эффективность
осеменения
свежеполученной спермой выше, чем замороженной. Для осеменения
используют сперму производителей первой племенной категории. При
отборе быков их оценивают по карио- типу с целью исключения
хромосомных аномалий. Потомство отобранных производителей не
должно иметь экстерьерно-конституциональных дефектов. Сперма
производителей, отбираемых для осеменения, должна характеризоваться
наивысшей
оплодотворяемостью,
не
ниже
85-90%.
Если
оплодотворяющая способность спермы быка составляет60% и менее, то
30
его выбраковывают.

31. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Для повышения оплодотворяемости доноров и выхода
эмбрионов, наряду с использованием высококачественной
спермы, необходимо определить сроки половой охоты для
своевременного
проведения
искусственного
осеменения.
Установлено, что гормонально индуцированная половая охота
длится в среднем 24 ч, хотя у отдельных коров она может продолжаться и дольше.
Имеются разные мнения специалистов о времени и
кратности осеменения коров с гормонально вызванной половой
охотой. В зарубежных странах, как правило, таких коров
осеменяют дважды: первый раз в начале появления половой
охоты и второй– через12-24 ч. В нашей стране коров–доноров
искусственно осеменяют дважды в день с интервалом 10-12 ч. Так
как при суперовуляции повышается число овулировавших
яйцеклеток, в каждой дозе спермы должно быть не менее 50 млн.
подвижных спермиев.
.
31

32. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Для искусственного осеменения коров – доноров
применяют три способа:
- визоцервикальный (с использованием влагалищного
зеркала);
- маноцервикальный (введение во влагалище руки в
перчатке и укороченной пипетки);
- ректоцервикальный (с фиксированием шейки матки и
контролем продвижения осеменительной пипетки с
помощью руки, введенной в прямую кишку).
Самую высокую эффективность искусственного
осеменения
коров-доноров
обеспечивает
ректоцервикальный способ.
.
32

33. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Извлечение и оценка эмбрионов. Оплодотворенные
яйцеклетки от суперовулированных коров-доноров могут быть
извлечены тремя способами: после убоя коровы-донора,
хирургическим и нехирургическим.
а) Извлечение эмбриона после убоя коровы-донора. Самым
простым и надежным способом извлечения эмбрионов является
убой коровы-донора. Известно, что яйцеклетки после овуляции и
оплодотворения на четвертые сутки переходят из яйцепроводов в
рога матки. Следовательно, если зиготы извлекать не позднее, чем
трое суток после искусственного осеменения, то достаточно
промыть лишь яйцепроводы, в которых находятся ранние
эмбрионы. Для вымывания достаточно 20-25 мл питательной
среды. Необходимо помнить, что время между убоем донора и
вымыванием эмбрионов не должно превышать 30-40 мин., то есть
эмбрионы должны быть получены до начала процесса клеточного
переваривания в половых органах.
.
33

34. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

б) Извлечение эмбриона хирургическим способом.
Извлечение эмбрионов хирургическим способом применяли в 70егоды. Для трансплантации рекомендуется использовать бластоцисты,
поэтому эмбрионы извлекают между 7-ми-–8-ми сутками после первого
искусственного осеменения.
Имеется несколько способов хирургического
извлечения
эмбрионов: разрез верхнего свода влагалища; лапаротомия (вскрытие) по
белой линии живота; лапаротомия в области голодной ямки.
Хирургический способ извлечения эмбрионов более трудоемок;
необходимы высокая квалификация хирурга, операционный зал и
стерильные условия и особенно важно, им нельзя пользоваться
многократно.
.
34

35. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

в) Извлечение эмбрионов нехирургическим способом.
Катетерный (нехирургический) способ извлечения эмбрионов
практически не вызывает каких-либо осложнений в организме животного.
Катетерным способом можно успешно извлекать эмбрионы в
животноводческом помещении. Эффективность способа высока,
повторность многократна. С помощью катетерного способа получают в
среднем 4.3 эмбриона от 86% коров–доноров. Вымывают эмбрионы на 7-8
сутки после осеменения. Для вымывания используют специальную
питательную среду Дюльбекко. Продолжительность манипуляции 20-50
мин.
Для получения эмбрионов этим способом разработаны
специальные катеторы, система биологически нейтральных шлангов,
сосуды для специальной среды и приема промывной среды с
эмбрионами. Промывную среду вводят в рога матки и удаляют из них с
помощью шприца. Фракционное (5-6 раз) промывание рогов матки
обеспечивает извлечение до76% эмбрионов.
.
35

36. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Оценка
эмбрионов.
Перед
пересадкой
реципиенту
необходимо оценить качество эмбриона, определить способ его
пересадки.
Оценивают
эмбрионы
различными
методами.
Основными из них являются: морфологический и метод окраски
эмбрионов. Считается, что степень точности морфологического
метода может быть доведена до90% и более. Качество или
жизнеспособность эмбрионов оцениваются на 7-8 сутки по
степени развития их до бластоцисты.
При морфологической оценке особое внимание обращают
на внешнюю форму зиготы, число бластомеров, равномерность
дробления, выраженность эмбриобласта и трофобласта, четкость
в очертании клеток, вакуализацию цитоплазмы– просветление ее
периферии, целостность клеточной мембраны и выход
цитоплазмы наружу. Оценивают под микроскопом при100-160
кратном увеличении.
.
36

37. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Существует несколько систем морфологической оценки
эмбрионов. Трехбалльная система: 3 – нормальные; 2 –
поврежденные; 1 – дегенерированные.
Четырехбалльная система: 4- превосходные; 3- хорошие; 2 –
посредственные; 1 – плохие.
В России принята пятибалльная шкала оценки качества
эмбрионов, учитывающая: целостность прозрачной оболочки;
равномерность дробления; состояние цитоплазмы; прозрачность
перивителлинового пространства; соответствие стадии развития.
Метод окраски эмбрионов основан на способности красителей
окрашивать морфологические структуры живой и мертвой клетки.
Прижизненную окраску эмбрионов проводят нетоксичными
диффузными красителями, равномерно окрашивающими клетки.
Живая клетка в неповрежденном состоянии практически не
окрашивается кислыми красителями.
.
37

38. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Пересадка эмбрионов реципиентам. В качестве
реципиента отбирают гинекологически здоровых коров
после двух-трех нормальных половых циклов с хорошими
воспроизводительными
качествами.
Продуктивные,
племенные и породные качества большой роли не играют.
Вместе с тем у реципиентов с плохой упитанностью, низкой
оплодотворяемостью после первого осеменения могут
плохо приживляться эмбрионы. В среднем на одного
донора
отбирают
5-6
реципиентов.
Большинство
специалистов считает, что в качестве реципиентов
наиболее пригодны полновозрастные телки с хорошими
племенными кондициями.
.
38

39. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Результаты пересадки эмбрионов у коров бывают
высокими только в том случае, если день овуляции у
доноров и реципиентов совпадает по времени. Для этого
проводят групповую синхронизацию половой охоты. Считается, что расхождение в синхронизации не должно
превышать± 12 ч. Для синхронизации охоты используют
простагландин и его аналоги. Одна из широко
применяемых схем синхронизации охоты следующая: в пер
вый день вводят тривитамин (15 мл.), на10-йи 21-йдень–
эстрофан (по 500 мкг), тривитамин (по 15 мл) и
биостимуляторы(кровь по40-60 мл или молозиво по10-20
мл и др.) Эмбрионы овцы могут быть пересажены без
снижения
эффективности
приживляемости
при
расхождении половой охоты донора и реципиента в 24-48 ч.
.
39

40. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

В настоящее время пересадка эмбрионов реципиентам
производится хирургическим и нехирургическим способами. При
хирургическом
способе
пересадки
эмбрионов
применяют
лапаротомию(вскрытие) по белой линии живота или в области
подвздоха. Лапаротомию проводят под общим наркозом при спинном
положении животного. Длина разреза по белой линии живота
составляет 10 см. Через разрез выводят наружу верхний отдел рога
матки и стенку его прокалывают тупой иглой. Стеклянную пипетку, в
которой находится эмбрион, вводят через отверстие внутрь рога матки,
затем выдавливают эмбрион вместе со средой. При некотором навыке
специалиста продолжительность хирургической пересадки эмбриона
составляет не более 10-15 мин. Эффективность хирургического
способа пересадки эмбрионов составляет 60-70%, а число телят 3-4 на
донора.
.
40

41. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

В последние 10-15 лет пересадку эмбрионов в основном
осуществляют нехирургическим способом. Основным преимуществом
этого способа кроме простоты и большой экономичности, является
возможность многократного использования реципиента. Разработано
несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Однако,
все они основаны на одном принципе– введении эмбриона в рог матки
через шейку, вследствие чего этот способ назван также цервикальным.
После необходимых обработок инструмента и наружных
половых органов катетер, в котором находится пайетта с эмбрионом,
осторожно вводят до шейки матки и под ректальным контролем
проводят через цервикальный канал, глубоко в рог матки ближе к его
верхней части и выталкивают эмбрион вместе со средой в просвет рога
матки. После пересадки эмбрионов проводят тщательный контроль за
реципиентами, обращая особое внимание на возможное проявление у
них повторной половой охоты.
41

42. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Для установления стельности у коров-реципиентов
используют несколько методов: визуальный; по уровню
прогестерона в крови или молоке; клинический, главным
образом, ректальным путем. При визуальном контроле
обращают внимание на 7-12-е сутки после пересадки
эмбрионов. Определение уровня прогестерона в крови или
молоке реципиентов проводят через 14-18 суток после
пересадки
эмбрионов.
Этот
метод
позволяет
диагностировать стельность с точностью не менее 85%, а
отсутствие беременности – до99%. На 60-есутки после
пересадки эмбрионов реципиентов исследуют на наличие
стельности ректальным способом.
.
42

43. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Особого
внимания
заслуживает
такой
прием,
как
нехирургическая пересадка двух эмбрионов по одному в каждый
рог матки, что еще больше повышает эффективность трансплантации.
Этот прием может быть применен для повышения частоты рождения
разнояйцовых (дизиготных) двоен. Он позволяет получать двойные
отелы у коров, особенно мясных пород, намного быстрее, чем
генетическим путем, то есть селекцией. Результаты проведенных
исследований
показывают,
что
нехирургическая
пересадка
дополнительного эмбриона во второй рог матки дает возможность
увеличить выход новорожденных телят на 30%.
Можно пересаживать эмбрион и оплодотворенной корове.
Средняя приживаемость эмбриона в осемененной корове при
нехирургической подсадке составляет 50%. Такой метод позволяет
получить более 50% двоен.
43

44. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Внедрение в практику племенных хозяйств методов
трансплантации эмбрионов и увеличения многоплодия коров
обусловливает необходимость определения происхождения телят. Для
этого широко используют группы крови животных. Кодоминантный
характер наследования групп крови и неизменяемость в течение всей
жизни особи позволяют использовать их на практике в качестве
маркеров. С помощью групп крови можно маркировать12 из 30
имеющихся в геноме у крупного рогатого скота хромосом,
контролировать техозяйственно-полезные признаки, гены которых
сцеплены с этими хромосомами.
Если биохимический признак у родителей отсутствует, то его не
может быть и у потомка, так как каждый потомок наследует один аллель
от отца, другой– от матери. В сомнительных случаях исследуют группу
крови у реципиента. Пробу крови берут у теленка в возрасте от 4
недель до 4 месяцев.
44

45. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Криоконсервация эмбрионов. С момента извлечения
эмбриона и до его пересадки проходит от 2-3 до 20-24 ч. Оптимальная
температура кратковременного хранения эмбрионов 8-12 0С,
продолжительность хранения 3-4 суток. Скорость охлаждения должна
быть медленной, чтобы исключить явление температурного шока. Для
кратковременного хранения и культивирования эмбрионов используют
синтетические среды с различными белковыми добавками: бычий
сывороточный альбумин, сыворотку крови хряков– кастратов и
нормальную сыворотку бычков– кастратов.
Кратковременное
хранение
в
половых
органах
промежуточного реципиента практикуют после реконструкции
эмбрионов и для транспортировки на дальнее расстояние. В качестве
промежуточных реципиентовиспользуют лабораторных животных
(кроликов, мышей и др.). Метод основан на высокой толерантности
слизистой половых путей самки в период течки и охоты к чужеродным
белкам. Сконструирована специальная камера для хранения
эмбрионов в брюшной полости реципиента. В такой камере эмбрионы
45
сохраняются в течение 72 часов.

46. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

При хранении замороженных эмбрионов (–196 гр.) имеется ряд
преимуществ, которые позволяют проводить пересадку в любое время,
создавать «банк» эмбрионов от высокоценных племенных животных,
генофонд малочисленных и исчезающих пород, транспортировать
эмбрионы в любое время года, в любую страну.
Для замораживания эмбрионов используют автоматические
программные замораживатели УОП-12. Чтобы уберечь эмбрионы от
разрушения при замораживании и оттаивании, применяют специальные
криозащитные вещества, легко проникающие в клетку, - криопротектор глицерин.
Среды
готовят
нафосфатно-солевомбуфере,
содержащем20% сыворотки крови и 100 тыс. ед. пенициллина. Перед
замораживанием эм- брионы помещают в криопротектор с
возрастающей концентрацией веществ для уравновешивания
осмотического давления. Затем их переносят в стеклянные пробирки,
стеклянные ампулы или пластиковые соломинки. Емкости с
эмбрионами маркируют.
.
46

47. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Существует быстрый способ криоконсервации. Емкости с
эмбрионами помещают в гнезда замораживающей камеры. Режим
замораживания включает несколько этапов: охлаждение от+20 0 С до–6
0С
со
скоростью1
0С/мин,
искусственную
кристаллизацию;
последующее охлаждение до– 35 0 С со скоростью0.3 0 С/мин; перенос
эмбриона в жидкий азот.
Кристаллизация происходит в период, когда температура
снижается с –5 0С до –7 0 С, при использовании глицерина в
соответствующей концентрации (1.0-1.4М).
Размораживают эмбрионы при 25 или37 0С в течение10-12 с в
водяной бане. Затем их переносят на часовое стекло и предварительно
оценивают. Окончательную оценку проводят после отмывания
эмбриона от криопротектора. Выживаемость эмбрионов должна быть
не ниже80%, стельность 55-60%, в этом случае трансплантация
зоотехнически и экономически рентабельна.
47

48. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Влияние трансплантации эмбрионов на генетический прогресс
популяции. Создание банков глубокозамороженной спермы и
разработка
методов
искусственного
осеменения
позволили
существенно увеличить интенсивность отбора быков и повысить
точность оценки их племенной ценности. На базе интенсивного
использования
генетически
ценных
быков–производителей
с
применением искусственного осеменения коров глубокозамороженной
спермой темпы селекции в популяции по сравнению с обычными
увеличиваются в 2-3 раза.
В то же время генетический вклад матерей быков в прогресс
селекции почти в два раза ниже вклада отцов быков. Это объясняется
низкой интенсивностью селекции матерей быков и ненадежной оценкой
их племенной ценности из-за получения небольшого числа потомков.
Эти ограничения и призвана частично снять трансплантация
эмбрионов. В настоящее время при использовании трансплантации
эмбрионов от одной генетически ценной коровы можно получать
двадцать телят, используя малоценных реципиентов.
.
48

49. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Однако, нередко возникает вопрос о влиянии реципиента на эмбриональное и постэмбриональное развитие трансплантата. Прямое
генетическое влияние на эмбрион реципиент не оказывает, так как
пересаженная зигота представляет сформированный генотип,
состоящий из гаплоидных наборов хромосом истинных родителей.
Отсутствие прямого генетического влияния реципиента на эмбрион
подтверждают межпородные и межвидовые пересадки зигот, а также
иммуногенетические исследования.
В тоже время могут быть вызваны модификации трансплантата, то есть
ненаследственные изменения признаков, обусловленные влиянием
организма реципиента во время стельности. В отличие от мутаций
модификациипонаследствуне передаются.
49

50. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

В странах с развитым молочным животноводством для повышения
генетического прогресса проводится интенсивный отбор коров –
потенциальных матерей быков. Таких коров высокой племенной
ценности используют в качестве доноров генетически ценных
эмбрионов. В США и Канаде более 50% племенных быков
голштинской породы были получены в результате трансплантации
эмбрионов. Теоретически обосновано, что если даже от каждой
отобранной коровы получать до 5 телят в год, то генетический
эффект улучшения больших популяций высокопродуктивного
молочного скота достигает 47%.
Таким образом, трансплантация эмбрионов может ускорить получение
выдающихся в генетическом отношении быков улучшателей при
совершенствовании существующих и создании новых популяций.
Интенсивное использование коров рекордисток в качестве доноров
позволяет не только получать племенных быков, но и создавать в
короткие сроки высокопродуктивные семейства.
50

51.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ
ИНЖЕНЕРИЯ
ЖИВОТНЫХ

52.

Трансформация
животного генома

53. Трансформация животного генома

Одними из носителей для введения чужеродной ДНК в
животную клетку являются векторы на основе ДНК вирусов (например,
SV 40, вирус бычьей папилломы) или на основе ретровирусов
(например, на основе вируса лейкоза мышей). Они легко проникают в
клетку хозяина, встраиваются в ее ДНК путем обычной инфекции и
обеспечивают высокоэффективный перенос генов. В основном
трансформацию животных клеток осуществляют либо с помощью
ретровирусов (около 40% от всех трансформаций), либо путем упаковки
ДНК в липосомы (сферические везикулы (это относительно маленькие
внутриклеточные органоиды, мембрано-защищённые сумки, в которых
запасаются или транспортируются питательные вещества), имеющие
один или несколько липидных биослоёв (25%).
Все генно-инженерные методы работы с клетками животных
можно разделить на 2 группы: эксперименты с соматическими клетками
и эксперименты по трансформации половых клеток. В последнем
случае конечный результат-получение трансгенных организмов.
53

54. Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих

Культуры трансформированных клеток млекопитающих используют
для получения различных веществ. Хотя культуры клеток животных, особенно
при массовом выращивании, гораздо менее экономичны, чем бактериальные
дрожжевые культуры, они обладают существенным преимуществом способностью осуществлять мелкие, но весьма важные модификации белков продуктов
гена
млекопитающих.
Например,
для
эффективного
функционирования ряда белков необходимо присоединение к ним цепочек из
молекул углеводов или липидов. Образование и присоединение таких цепочек обычный процесс для клеток млекопитающих, тогда как бактериальная клетка
не способна производить подобные модификации.
Помимо создания клеток-продуцентов, трансформация соматических
клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции
экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат
клетки животных, а при необходимости и человека, что имеет огромное
значение для медицинской генетики.
54

55. Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих

Культуры клеток млекопитающих могут оказаться эффективным
источником выделения некоторых вирусных антигенов с целью
получения вакцин для животных и человека. Получение таких
вакцинных культур клеток осуществимо при помощи техники
рекомбинантных ДНК и эффективных векторов экспрессии для клеток
млекопитающих и человека. При использовании ДНК-вакцин в
организм вводится не антиген, а ген, кодирующий синтез этого антигена.
Ген встраивается в плазмиду, а плазмида вводится в организм путем
обыкновенной инъекции. ДНК-вакцины имеют хорошие перспективы в
животноводстве. В стадии клинических испытаний в настоящее время
находятся ДНК-вакцины против микоплазм, возбудителя туберкулеза,
сальмонеллеза, лейшманиоза. Развитие злокачественной опухоли в
организме обычно подавляет иммунитет. Проблема в том, чтобы
подхлестнуть иммунную систему в целом и направить ее действие
против раковых клеток. Исследователи из Медицинской школы в ЭннАрборе (Мичиган) придумали метод борьбы с раком.
55

56. Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих

В опухолевые клетки толстой кишки подопытных мышей ввели
гены, кодирующие белки другой линии мышей. После появления на
внешней стороне клеточной мембраны этих белков трансгена иммунная
система атаковала опухолевые клетки. 20% больных мышей
выздоровели, у 70% опухоль уменьшилась, в контрольной группе все
умерли. Лимфоциты боролись не только с «меченными» клетками
опухоли, но и клетками метастаз, следовательно, иммунная система
«проснулась». В настоящее время ведутся эксперименты на людях с
раком кожи.
56

57. Генетическая трансформация половых клеток животных

Если вводить ДНК в клетки сформированного
организма, изменится лишь небольшое число клеток. В
этом случае животное будет химерным, т.е. разные ткани
будут иметь разный генотип. Для изменения свойств всего
организма, необходимо изменить геном половых клеток или
зиготы.
Существуют
две
основные
схемы
создания
трансгенных животных: микроинъекции чужеродной ДНК и
введение генетической конструкции в эмбриональные
стволовые клетки.
57

58. Генетическая трансформация половых клеток животных

Микроинъекции чужеродной ДНК. Микроинъекцию
клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что
оплодотворенной яйцеклетки. Чаще выбирают мужской пронуклеус.
После инъекции клетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной
(суррогатной) матери или дают ей возможность развиваться в культуре
до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.
Недостатки этого метода – трудоемкость и низкая
эффективность. Полного развития достигают менее 1-5% зигот.
Можно вводить ген в сперматозоиды и затем проводить ими
оплодотворение. Таким образом были введены гены интерферона и
инсулина человека, ген в-глобина кролика и др.
58

59. Генетическая трансформация половых клеток животных

Введение
генетической
конструкции
в
эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). ЭСК получают
из бластоцист, когда число бластомер не превышает 8. Они
обладают тотипотентностью (плюрипотентностью). Эти
клетки культивируют ин витро и после введения в них
необходимого трансгена вводят в другой эмбрион на стадии
бластоцисты, а затем имплантируют в матку суррогатной
матери.
Такой путь получения трансгенных животных выгоден
тем, что используются не зиготы, а бластоцисты. Их легко
получать нехирургическим путем из половых путей самок
крупных видов млекопитающих и трансплантировать
суррогатным
матерям
для
рождения
трансгенных
животных.
59

60. Генетическая трансформация половых клеток животных

По статистике, получается одно модифицированное
животное из 40 зигот мышей, 100 зигот овцы или козы, 1500
зигот коровы. И из полученных животных лишь 50%
экспрессируют
трансгенный
белок
или
способны
передавать этот ген потомству.
60