Разнообразие денитрифицирующих бактерий из низкотемпературных месторождений тяжёлой нефти

1. Разнообразие денитрифицирующих бактерий из низкотемпературных месторождений тяжёлой нефти

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
Биологический факультет
Кафедра микробиологии
Разнообразие денитрифицирующих бактерий
из низкотемпературных месторождений
тяжёлой нефти
Ершов Алексей Павлович
Научный руководитель:
д.б.н. Назина Т. Н.
Лаборатория нефтяной микробиологии ФИЦ Биотехнологии РАН

2. Сульфатредукция в нефтяных пластах

• При добыче нефти с использованием технологии заводнения
активизируются микробные процессы в нефтяном пласте.
• Активизация
жизнедеятельности
сульфатредуцирующих
бактерий приводит к увеличению содержания сероводорода в
пластовой воде, нефти и газе.
Накопление сероводорода
в нефтяном пласте вызывает:
• Коррозию оборудования
• Ухудшение качества нефти
• Ухудшение экологии
2

3. Денитрификация в нефтяных пластах

Активизация денитрифицирующих бактерий нефтяного
пласта позволяет подавить образование сероводорода:
• Восстановление нитратов энергетически более выгодно,
чем восстановление сульфатов.
• Образуемый нитрит является токсичным для многих
сульфатредуцирующих бактерий.
• Нагнетание в пласт нитратов вместе с водой позволяет
стимулировать рост денитрификаторов и подавляет рост
сульфатредуцирующих прокариот в нефтяном пласте.
3

4. Цель и задачи работы

Цель работы: изучение разнообразия денитрифицирующих бактерий в
месторождениях тяжелой нефти и оценка возможности их стимуляции
для подавления сульфатредукции.
Задачи работы:
• Получить накопительные культуры денитрифицирующих бактерий в
среде с нефтью.
• Определить образование нитритов накопительными культурами
денитрифицирующих бактерий на разных субстратах.
• Изучить состав накопительных культур молекулярными методами.
• Выделить
из
исследуемых
сообществ
чистые
культуры
денитрифицирующих бактерий, растущие на углеводородах.
• Сравнить потребление н-алканов нефти чистыми культурами в
аэробных условиях и анаэробно в присутствии нитратов.
• Определить влияние нитратов
сообществом нагнетаемой воды.
на
образование
сероводорода
4

5. Объект исследования

Объектом исследования были микробные
сообщества,
полученные
из
проб
пластовой
и
нагнетаемой
воды
Черёмуховского и Восточно-Анзирского
нефтяных месторождений Татарстана:
• Добывающая скважина 5452
• Нагнетательная скважина 5600
• Добывающая скважина 245Д
• Нагнетательная скважина 1010
Накопительные культуры получали путём
посева проб воды в среду с нефтью и
нитратом и их культивирования в
анаэробных условиях в течение 1 года.
5

6. Рост накопительных культур денитрифицирующих бактерий на тяжёлой нефти

(сут)
(сут)
6

7. Накопление нитритов сообществами денитрификаторов на разных субстратах

100
(сут)
(сут)
14
(сут)
(сут)
Сообщество 1010
NO₂⁻, мг/л
80
60
40
20
0
0
Глюкоза
2
4
Лактат
6
8
10
Глицерин
12
Этанол
7

8.

Состав денитрифицирующего сообщества 245Д
8

9.

Состав денитрифицирующего сообщества 5452
9

10. Чистые культуры денитрифицирующих бактерий

Штамм
Ближайший вид
Сходство генов
16S рРНК, %
Скважина
HO-A7
Bacillus licheniformis
99.3
245Д (доб.)
HO-A12
Nocardia asteroides
99.3
5600 (нагн.)
HO-A13
Gordonia amicalis
100.0
5600 (нагн.)
HO-A21
Pseudoxanthomonas mexicana
99.6
5600 (нагн.)
HO-A22
Ensifer adhaerens
98.4
5600 (нагн.)
HO-A23
Pseudomonas brassicacearum
99.4
1010 (нагн.)
HO-A24
Pseudomonas synxantha
98.4
1010 (нагн.)
HO-A25
Halomonas alimentaria
97.5
5452 (доб.)
10

11. Рост чистых культур денитрифицирующих бактерий на нефти

Использование н-алканов нефти
Bacillus licheniformis
1,04
1,02
1,16
Nocardia asteroides
1,10
1,38
Gordonia amicalis
1,15
1,05
Pseudoxanthomonas mexicana
Ensifer adhaerens
1,07
1,14
1,02
1,08
Pseudomonas brassicacearum
1,12
1,18
Pseudomonas synxantha
Halomonas alimentaria
1,10
1,03
1,06
Коэффициент биодеструкции нефти
Аэробный рост
Рост на нитрате
11

12. Подавление роста сульфатредуцирующих бактерий продуктами денитрификации

• Пробы нагнетаемой воды высевали на элективную среду для
сульфатредуцирующих бактерий и измеряли количество образуемого
сероводорода.
• В контрольном варианте нитраты отсутствовали, в опытный вариант
вносили 1 г/л нитрат-иона.
Образование сероводорода
• Количество сероводорода
1,0
S²⁻, ммоль/л
• Культивировали 7 суток
по сравнению с контролем
0,5
уменьшалось на 30%
0,0
Глюкоза
Без добавления нитрата
Лактат
С добавлением 1 г/л NO₃⁻
12

13. Выводы

• Показано присутствие в нагнетаемых и пластовых водах нефтяных
месторождений
Республики
Татарстан
денитрифицирующих
бактерий, способных использовать н-алканы нефти, и образовывать
биосурфактанты, снижающие межфазное натяжение среды, что может
способствовать дополнительному извлечению нефти из пласта.
• Рост денитрифицирующих микробных сообществ на сырой нефти и
ряде органических субстратов сопровождается восстановлением
нитратов до нитритов, что свидетельствует о возможности их
активации в пласте для подавления роста сульфатредуцирующих
прокариот.
• Выделены 8 штаммов денитрифицирующих бактерий, способных
использовать н-алканы нефти в аэробных условиях и анаэробно в
присутствии нитратов.
• Стимуляция
денитрифицирующих
бактерий
сопровождается
снижением образования сероводорода и может использоваться в
биотехнологии для предотвращения коррозии нефтепромыслового
оборудования и улучшения качества добываемой нефти.
13

14. Спасибо за внимание!

Работа выполнена при поддержке РНФ (грант № 16-14-00028).