Молекулярная биология. Работа в лаборатории

1. What is science?

Марьянчик Софья Вадимовна
биол. факультет МГУ им. М.В. Ломоносова; МПГУ
1
+7(925)884-27-71; [email protected]

2. Блок II «Молекулярная биология. Работа в лаборатории»

Лабораторные (и не очень) животные
ПЦР, гель-электрофорез
ИФА
Секвенирование
Цитометрия
2

3. Проточная цитометрия

3

4. Блок-схема проточного цитометра

4

5. Блок-схема проточного цитометра

Основные элементы:
1) Гидравлика
Ламинарный поток
жидкости
2) Оптика
Лазер
Объектив
Светофильтры
3) Электроника
ФЭУ (фотоэлектронный
умножитель)
5

6. Основные компоненты цитометра

• Гидравлическая система
– система для создания
ламинарного потока жидкости с
регулируемой подачей частиц.
Забирает образец внутрь
прибора, а потом подает в
кювету под регулируемым
давлением.
Обеспечивает правильное
расположение анализируемых
частиц в ламинарном потоке
6

7.

Выравнивание частиц
в ламинарном потоке
7

8. Схема действия гидравлической системы

8

9. Основные компоненты цитометра

• Оптика
- Лазеры / светодиоды – монохроматичные источники света
(постоянная длина волны)
основной лазер: 488 нм
Что это значит???
9

10.

488 нм
561 нм
Как должны
Зачем цитометру
располагаться
лазеры, чтобы
так много
освещалась
каждая
лазеров?
клетка?
642 нм
405 нм
10

11. Расположение лазеров и светофильтров

Зачем нужны светофильтры?
Почему их несколько и они
расположены друг за другом?
11

12. Блок-схема проточного цитометра

Основные элементы:
1) Гидравлика
Ламинарный поток
жидкости
2) Оптика
Лазер
Светофильтры
3) Электроника
ФЭУ (фотоэлектронный
умножитель)
12

13.

Основные компоненты цитометра
• Оптическая система (светофильтры и дихроичные зеркала)
4 типа светофильтров
13

14.

Основные компоненты цитометра
• Оптическая система (светофильтры и дихроичные зеркала)
2 типа светдихроичных зеркал
• Как вы думаете, какие элементы оптики из
рассмотренных нами, используются в
цитометрии наиболее часто?
14

15. Оптическая схема проточного цитометра

15

16. Зеркальная система светофильтров

- Состоит из светофильтров с полосой пропускания (Band pass),
позволяющих последовательно отражать свет, разделяя его на
несколько спектральных участков.
Тригональный и октагональный светоделители BD Bioscience
16

17. Зеркальная система светофильтров

- Состоит из светофильтров с полосой пропускания (Band pass),
позволяющих последовательно отражать свет, разделяя его на
несколько спектральных участков.
Зачем столько светофильтров?
(Возможность детекции до 7 флуоресцентных
каналов от 1 лазера!)
17

18. Перевод флуоресценции на «язык» компьютера

• Электроника (ФЭУ)
ФЭУ – фотоэлектронный умножитель; переводит фотоны в поток
электронов, многократно и пропорционально увеличивая силу тока.
18

19. Оцифровка сигнала – 3 параметра

W – ширина на
полувысоте
H – высота
A – площадь
Какой показатель по Вашему мнению
является наиболее точным?
19

20. Показатели прямого и бокового светорассеяния

FSC – прямое светорассеяние, определяется
размерами объекта, проходящего токе
жидкости.
Минимальный детектируемый размер – 0,5 мкм
SSC – боковое светорассеяние, определяется
степенью гранулярности клетки.
Максимальный сигнал дают включения
величиной 0, 5 мкм
20

21. Представление результатов (Двухпараметрический график)

(FL-2)
(FL-1; FL-2)
(FL-1)
21

22.

Представьте, что вы анализируете образец крови методом
проточной цитометрии.
Как будут располагаться клетки крови на
двухпараметрическом графике при анализе показателей
FSC и SSC?
Гейтинг – выделение и анализ интересующей популяции клеток
22

23. Флуоресценция

- физический процесс, разновидность люминесценции.
Флуоресценцией обычно называют излучательный переход
возбуждённого состояния с самого нижнего синглетного колебательного
уровня S1 в основное состояние S0
23

24. Флуоресценция

- физический процесс, разновидность люминесценции.
Флуоресценцией обычно называют излучательный переход
возбуждённого состояния с самого нижнего синглетного колебательного
уровня S1 в основное состояние S0
24

25. Правило Стокса

Спектр флуоресценции всегда имеет большую длин волны, чем спектр
поглощения
25

26. Правило Стокса

Спектр флуоресценции всегда имеет большую длин волны, чем спектр
поглощения
26

27. Творческое задание (работа в группах)

Ваша задача: проанализировать образец крови методом проточной
цитометрии и проанализировать количество CD4 и CD8 Т-лимфоцитов.
Каким образом вы будете проводить гейтинг?
По каким параметрам будете анализировать популяции клеток?
Что вы ожидаете увидеть на графиках?
https://biomolecula.ru/articles/12-metodov-v-kartinkakh-protochnaia-tsitofluorimetriia
27

28. Спасибо за внимание! 

Спасибо за внимание!
P.S. Следующее занятие – последнее! …
28

29. Клеточные технологии

• Зачем нам культивировать клетки?
• Что такое клеточная культура?
• Приведите аргументы в пользу и против
использования клеточных технологий
Клеточная культура - клетки, принадлежащие
одной ткани, искусственно выращиваемые в
специальной среде под контролируемыми
внешними условиями (питат. вещ-ва,
температура, влажность, содержание CO2 и др.)
https://biomolecula.ru/articles/metody-v-kartinkakh-kletochnye-tekhnologii
29