Исследование живых клеток методом атомно-силовой микроскопии Нижний Новгород

1.

Исследование живых клеток методом
атомно-силовой микроскопии
Нижний Новгород
2020
1

2.

Виды микроскопов
Оптические микроскопы
•Ближнепольный оптический микроскоп
•Конфокальный микроскоп
•Двухфотонный лазерный микроскоп
Электронные микроскопы
•Просвечивающий электронный микроскоп
•Растровый электронный микроскоп
Сканирующий зондовый микроскоп
•Сканирующий атомно-силовой микроскоп
•Сканирующий туннельный микроскоп
Рентгеновские микроскопы
•Рентгеновские микроскопы отражательные
•Рентгеновские микроскопы проекционные
• Лазерный рентгеновский микроскоп
(XFEL)
2

3.

∗ В 1982 году (момент опубликования в
Phys. Rev. Lett.) Генрихом Рорером и
Гердом Биннигом был открыт метода
сканирующей туннельной
микроскопии.
∗ В 1986 году Гердом Биннигом,
Кельвином Куэйтом и Кристофером
Гербером в США, был изобретен
первый атомно-силовой микроскоп.
3

4.

Атомно-силовая микроскопия — вид зондовой микроскопии, в основе
которого лежит силовое взаимодействие атомов зонда и исследуемого образца.
∗ Атомно-силовой микроскоп (АСМ, англ. AFM – atomic-force microscope) -
сканирующий зондовый микроскоп высокого разрешения. Используется для
определения рельефа поверхности с разрешением от десятков ангстрем вплоть до
атомарного.
∗ В отличие от сканирующего туннельного микроскопа, с помощью атомно-
силового микроскопа можно исследовать как проводящие, так и непроводящие
поверхности.
4

5.

Зонд АСМ
В
сканирующих
зондовых
микроскопах
исследование
микрорельефа поверхности и ее
локальных свойств проводится с
помощью специальным образом
приготовленных зондов в виде
игл. Рабочая часть таких зондов
(острие) имеет размеры порядка
десяти нанометров. Характерное
расстояние между зондом и
поверхностью
образцов
в
зондовых
микроскопах
по
порядку величин составляет 0,1 –
10 нм.
5

6.

Сравнительные размеры зондов
6

7.

Принцип работы АСМ
На расстоянии около одного ангстрема
между атомами образца и атомом зонда
(кантилевера)
возникают
силы
отталкивания, а на больших расстояниях силы притяжения.
Идея устройства очень проста: кантилевер,
перемещаясь относительно поверхности и
реагируя на силовое взаимодействие,
регистрирует ее рельеф. На основании
прибора укреплен цилиндр, в котором
находится сканер – пьезоэлектрическая
керамика, изменяющая свои размеры при
приложении электрического поля
7

8.

8

9.

9

10. Режимы работы АСМ

Кантилевер
непосредственно
касается
поверхности и повторяет её форму по мере
прохождения поверхности
Бесконтактный
и
полуконтактный
режим
характеризуются
дополнительным
условием
сканирования, которое позволяет осуществить
более щадящее и тонкое сканирование.
Кантилевер жестко связывается с пъезоэлементом
и колеблется со своей резонансной частотой.
Детектируется не только амплитудное отклонение,
но и фазовое.
10

11.

Преимущества:
∗
∗
∗
Атомно-силовая микроскопия позволяет получить истинно трёхмерный рельеф
поверхности;
Изучаемая поверхность не требует нанесения проводящего металлического
покрытия, которое часто приводит к заметной деформации поверхности.
Большинство режимов атомно-силовой микроскопии могут быть реализованы на
воздухе или даже в жидкости.
Недостатки:
∗
∗
∗
Небольшой размер поля сканирования.;
Низкая скорость сканирования поверхности, по сравнению с электронным
микроскопом;
Нелинейность, гистерезис и ползучесть (крип) пьезокерамики сканера,
являются причинами сильных искажения АСМ-изображений.
11

12.

Нейтрофильный гранулоцит
Сегментированное ядро
Гранулы
В крови человека содержится 2,0–7,5×109/л
нейтрофилов, что составляет 50–70% от
общего числа лейкоцитов крови. В кровотоке
присутствует только 1–2% общего числа
зрелых нейтрофилов в организме (остальные
представлены в тканях, преимущественно в
костном мозгу). Диаметр нейтрофилов
составляет 9–12 мкм. Им свойственна
уникальная
морфология:
ядро
сегментированное (обычно состоит из 3
сегментов)
с
плотно
упакованным
хроматином цитоплазма содержит гранулы.
12

13.

Функции нейтрофильных гранулоцитов
Миграция
Роллинг
(селектинрецепторн
ые
взаимоде
йствия
13

14.

Диапедез НГ
14

15.

Парацеллюлярная
миграция НГ
15

16.

Контроль
Характерна небольшая максимальная и
средняя высота клеток, внешний вид клеток
однообразен. Псевдоподии отсутствуют, что
свидетельствует об отсутствии активации
клетки. Преобладает площадь адгезии клетки.
В ряде случаев можно наблюдать сегменты
ядра.
6 мкм
6 мкм
30.06 mkm
30.06 mkm
Сегменты ядра
90.0°
90.0°
-90.0°
-90.0°
15.03 mkm
15.03 mkm
6 мкм
6 мкм
6 мкм
16
0 mkm
0 mkm
0 mkm
15.03 mkm
30.06 mkm

17.

30.06 mkm
90.0°
-90.0°
15.03 mkm
0 mkm
0 mkm
15.03 mkm
30.06 mkm
17

18.

КТ 1
Морфология клеток разнообразна, в
большинстве
случаев
форма
не
правильная. Клетки выше. Площадь
адгезии
уменьшается.
Отмечаются
повреждения некоторых нейтрофилов.
Ряд клеток морфологически напоминают
нейтрофилы из контрольных образцов.
6 мкм
6 мкм
Апопотическое тельце
6 мкм
6 мкм
6 мкм
18

19.

КТ 2
6 мкм
6 мкм
Морфология клеток разнообразна.
Во многих случаях большое
количество
псевдоподий,
что
свидетельствует об активации.
Визуально клетки выше чем в
контроле.
Поверхность
неоднородна.
На
подложке
большое количество фрагментов
похожих на разрушенные клетки.
Сегменты
ядра
не
визуализируются.
6 мкм
6 мкм
6 мкм
19

20.

КТ-3
6 мкм
6 мкм
Морфология клеток однообразна. Края
ровные. Форма чаще правильная в
большинстве случаев близка к округлой
или куполообразной. Нет признаков
активации. Площадь адгезии меньше.
Высота значительная. Поверхность
чаще однородная. Разрушенных клеток
мало.
6 мкм
6 мкм
6 мкм
20

21.

КТ- 4
Морфология сходна с клетками в
предыдущем эксперименте, но более
разнообразна.
Высота
увеличивается
относительно контроля. Площадь адгезии
так же значительно меньше чем в
контроле. В ряде случаев поверхность
клеток
грубо
деформирована.
Есть
частично разрушенные клетки.
6 мкм
6 мкм
6 мкм
6 мкм
6 мкм
21

22.

КТ- 5
В большинстве случаев форма клеток
правильная, округлая или куполообразная.
Размер клеток заметно меньше чем в
остальных образцах. У многих клеток
поверхность не однородная, зернистая.
Разрушенных клеток не много. Псевдоподии
встречаются у очень малого числа клеток.
6 мкм
6 мкм
6 мкм
6 мкм
6 мкм
22

23.

КТ-6
Клетки
преимущественно
однообразны, правильной округлой
или
куполообразной
формы.
Встречаются
псевдоподии.
Поверхность клеток не однородна. В
образце
наблюдается
большое
количество разрушенных клеток.
6 мкм
6 мкм
6 мкм
6 мкм
6 мкм
23

24.

Международный номенклатурный комитет по клеточной
гибели официально выделяет 12 типов клеточной гибели
24

25.

Механизмы гибели нейтрофильных гранулоцитов
(фиксированные клетки)
а
б
6 мкм
г
в
6 мкм
д
6 мкм
6 мкм
е
6 мкм
6 мкм
Гибель нейтрофилов под воздействием КТ: а - контроль; б - апоптоз ; в - быстрый нетоз ;
г - аутофагия; д - некроз; е-мумификация.
25

26.

Основные механизмы гибели нейтрофилов
Для исхода воспалительного процесса важно по какому механизму погибают нейтрофилы:
Others
DAMPs
ATP
Enzymes
Signal
inducing
cell
programmed
death
Phosphorylation
Protein
kinase
MLKL
DAMPs
Inflammation
HMGB1
Inflammation
Inflammasoma
NLRP3
IL1β
Некроз
Некроптоз
26

27.

Динамика некроза нейтрофилов, исследованная методом АСМ
40
35
30
30
20
25
Volume of cell, mkm
3
Volume of nucleus, mkm
3
40
20
10
0
5
10
15
20
25
30
Time, min
27

28.

Основные механизмы гибели нейтрофилов
Lysosome
p62
Autolysosome
Bacteria
UB
LC3
Autolysosome
Bacteria
Bacteria
Phagophore
UB
Vacualisation of
cytoplasm
p62
Regulation of
inflammation
Аутофагия
Cell death by
autophagy
6 мкм
28

29.

caspase – 8 – activation
caspase – 9 – activation
cytochrome C
+
APAF1
Mitochondria
Activation of effector caspases cascade
Основные механизмы гибели нейтрофилов
Apoptosis
bodies
Apoptosis
Without inflammation
Апоптоз
29

30.

Основные механизмы гибели нейтрофилов
Bacteria
Signal inducing
NET formation
Inflammation
MPO
NE
Localisation and
resolution of
inflammation
ROS
Adhesion
Нетоз
30

31.

Изучение динамики формирования нетоза в живых препаратах
после инкубации со S.aureus
Опсонизиро
ванный
S. aureus
25 мкм
70 мин
20 мкм
85 мин
45 мкм
95 мин
31

32.

Изучение динамики формирования нетоза в живых препаратах
после инкубации со S.aureus
Обрезание ДНК зондом
после первого сканирования
45 мкм
105 мин
Клетка после формирования длинных нетотических сетей
полностью расходует свое внутреннее содержимое и
идентифицируется только как «тень» клетки
45 мкм
115 мин
45 мкм
125 мин
32

33.

Структурно-морфологические особенности
классического нетоза, исследованные методом СЭМ
10 мкм
8 мкм
33

34.

Исходы разных вариантов клеточной гибели
34

35.

Основные черты нетоза, идентифицированные АСМ
Хеликсы ДНК распространяются волнообразно целыми блоками;
Постепенно наблюдается бифуркация и отделение отдельных нитей ДНК;
Отдельные ферменты оказываются «замаскированными» в блоках;
Позднее, при отделении отдельных цепочек ДНК видны глобулярные иовальные структуры, которые
по всей вероятности соответствуют гистонам и ферментам;
В начале формирования блоки хеликсов окружены защитной мембраной;
Происходит истончение спиральных нитей, вероятно из-за деконденсации ДНК;
Возможно формируемые нетозные сети обладают своего рода хемотаксической активностью, поскольку
наблюдается их движение к опсонизированному стафилококку;
Весь клеточный материал полностью расходуется на формирование сетей;
35
Достижение нетозной сеткой нейтрофила стимулирует формирование им следующей нетозной сетки.

36.

Проблемы исследования нетоза методом АСМ
200 мкм
100 мкм
36

37.

Мумификация впервые была открыта методом АСМ
Мумификация нейтрофилов, исследованная методом АСМ
Pleskova S.N. The use of the light microscopy and the atomic force microscopy for studying cell death under hydrogen peroxide influence. «Current
microscopy contributions to advances in science and technology». Editor: Antonio Méndez-Vilas. Publisher: Formatex Research Center. Volume 1 ISBN
(13): 978-84-939843-5-9. Publication date: December 2012 p. 602 – 609.
Pleskova S.N., Mikheeva E.R., Gornostaeva E.E. The Interaction between Human Blood Neutrophil Granulocytes and Quantum Dots // Micron. 105
(2018) 82–92. Doi: 10.1016/j.micron.2017.11.011
Pleskova S.N., Gorshkova E.N., Novikov V.V., Solioz M. Treatment by serum up-conversion nanoparticles in the fluoride matrix changes the mechanism 37
of cell death and the elasticity of the membrane // Micron. 2016. – V. 90. P. 23 – 32.

38.

Диаграмма силовых кривых воздействия кантилевера на мембрану
живых клеток программы
38

39.

Причина
Нейтрофилы в контроле 26.75 ± 2.49 kPa
Особенности
Мумифицированные нейтрофилы
143.21 ± 22.19 kPa
39

40.

100 нм
40

41.

Спасибо за
внимание
41