Высокоэффективная жидкостная хроматография 2

1. Аппаратурное оформление метода ВЭЖХ

Хроматограф – набор устройств,
выполняющих вспомогательные функции
по отношению к хроматографической
колонке

2.

ПОЛНАЯ СХЕМА
ЖИДКОСТНОГО ХРОМАТОГРАФА

3. Блочно-модульные хроматографы

• Модульная система позволяет быстро менять
конфигурацию
• Широкий выбор модулей позволяет гибко решать
различные задачи
• Удобный доступ для мелкого ремонта и
профилактики
• Возможность наращивания блоков под новые задачи

4. Жидкостные хроматографы Up-grade

Возможность наращивания блоков под новые задачи

5. Жидкостные хроматографы Up-grade

Возможность наращивания блоков под новые задачи

6. Системы подачи растворителей

Основные требования:
•Постоянство подачи подвижной фазы (<1%)
•Отсутствие пульсаций
•Рабочее давление
до 400 бар
•Точность установки расхода
•Диапазон расхода
•Материал жидкостного тракта
•Сервисные устройства

7. Шприцевые насосы

«Миллихром», «Питон»
(+) Отсутствуют пульсации
(-) Рабочее давление до 50 бар

8. Поршневые насосы

9.

Градиентные системы
формирование
линейно-кусочного
градиента
состава подвижной фазы на
линии высокого давления с высокой
воспроизводимостью (двухкамерный
динамический смеситель потока)
- возможность установки до четырех
насосов
высокого давления, а также выбора
материала
жидкостного тракта
- выбор детектора и дополнительных
устройств (термостатов, автосамплеров,
систем
переключения потока и систем
постколоночной
дериватизации.
-

10. Преимущества градиентного элюирования

• Одновременное определение слабо- и
сильноудерживаемых компонентов
• Сокращение времени анализа
• Улучшение формы пика
сильноудерживаемых компонентов и
понижение предела обнаружения
• Удаление сильноудерживаемых
примесей с колонки

11.

12. Устройства Ввода Пробы

-Ручные
-Автоматизированнные

13.

Ввод пробы в хроматограф
Игловой порт
«LOAD»
(поворот
ручки
инжектора
в крайнее
правое
положение
«Загрузка»)

14.

Диаграмма потоков инжектора с
встроенным игловым портом

15.

16. Технические характеристики автосамплера

Термостат и блок контроля
температуры
Твердотельный термостат
Интервал температур:
комнатная - 100ºС
Точность поддержания
±0,1 ºС
Возможность
термостатирования
инжектора
Длина колонки – до 300 мм

17. Термостат и блок контроля температуры

Достоинства применения
термостатирования
•Уменьшение вязкости элюента, уменьшение давления или
увеличение скорости подачи элюента
•Повышение скорости массопереноса, уменьшение времени
анализа
• Возрастание эффективности и чувствительности анализа
•Улучшение воспроизводимости удерживания и площади
пика
•Снижение дрейфа базовой линии

18. Достоинства применения термостатирования

Дегазатор

19. Дегазатор

Детектирование в
жидкостной
хроматографии

20. Детектирование в жидкостной хроматографии

Детектор – устройство,
предназначенное для
обнаружения и количественного
определения выходящих из
колонки в потоке подвижной
фазы компонентов
анализируемой смеси
Регистрация веществ осуществляется за счет
преобразования в электрический сигнал
изменений в составе подвижной фазы

21.

Классификация детекторов
• Универсальные (реагируют на изменение
свойства подвижной фазы) и селективные
(реагируют на присутствие определяемого
вещества)
• Деструктивные и недеструктивные
• Потоковые (чувствительность зависит от
количества вещества в ячейке) и
концентрационные (чувствительность зависит
от концентрации компонента в элюенте)

22. Классификация детекторов

Параметры детектора:
Чувствительность
Шум
Линейность
Стабильность работы
Объем ячейки

23.

Чувствительность и
предел обнаружения
• Чувствительность – крутизна
градуировочно графика
• Предел обнаружения – концентрация,
которую можно обнаружить по данной
методике с заданной вероятностью

24. Параметры детектора:

отклик
Чуствительность и предел
обнаружения
2
δ
1
Cн1 Cн2
S1 > S 2
Cн1 > Cн2
C
3δ
Cmin = (3δ / H)*S
Cн = (10δ / H)*S
Сравнение возможностей детекторов
проводится по пределам обнаружения
(соотношению сигнал/шум)!

25. Чувствительность и предел обнаружения

отклик
Линейный диапазон
Идеальный детектор
Реальный отклик
Предел обнаружения
Уровень шума
Линейный диапазон
Динамический диапазон
C
Широкий линейный диапазон
обеспечивает одновременное
определение макро- и микрокомпонентов в пробе!

26. Чуствительность и предел обнаружения

Стабильность работы
детектора
Идеальны
й случай
Реальная
базовая
линия
дрейф
шум
Шум – пульсации базовой линии во временном интервале,
когда через ячейку детектора протекает чистый растворитель.
Минимальный шум определяется пульсациями насоса.
Дрейф – смещение нулевой линии за определенный
промежуток времени при отсутствии каких- либо элюируемых
из колонки веществ

27. Линейный диапазон

Объем ячейки
• Объем ячейки не должен превышать
0,1 объема зоны элюата первого пика

28. Стабильность работы детектора

Основные требования к детекторам
Малый дрейф и шум базовой линии
Высокая чувствительность
Быстрый отклик
Широкий рабочий диапазон
Малый мертвый объем
Конструкция ячейки, препятствующая
размыванию зон и образованию пузырей
Малая чувствительность к изменению фоновых
параметров (температура, скорость элюента,
процент органического модификатора)
Простота и надежность конструкции
Применимость к широкому кругу объектов
Недеструктивность

29. Объем ячейки

Идеальных детекторов не
существует, поэтому следует
выбирать такой детектор,
характеристики которого
наиболее полно соответствуют
целям анализа

30. Основные требования к детекторам

Детекторы для ВЭЖХ
№ Детектор
Универсальность
1
Рефрактометрический
Да
Предел обнаружения,
мкг/мл
10
2
Кондуктометрический
Да
0,01
3
Спектрофотометрический
Нет
0,001
4
Флюорометрический
Нет
0,0001
5
Амперометрический
Нет
0,0001

31.

Устройство рефрактометрического детектора
При прохождении луча через 2 кюветы (сравнения и
измерительной), луч отклоняется на угол пропорциональный
разности показателей преломления. Отклоненный луч
не попадает на фоторезистор, происходит разбалансировка
в электрических схемах, регистрируемая устройством
для сбора данных.

32. Детекторы для ВЭЖХ

Регистрация сигнала
Чувствительность детектирования пропорциональна
разности показателей преломления подвижной фазы
и определяемого компонента
Коэффициент преломления разбавленных растворов
изменяется пропорционально изменению концентрации
растворенного соединения
Коэффициент преломления обычно изменяется в
пределах 1.30-1.90
Современные рефрактометры фиксируют до 1*10-8
изменения показателя преломления

33.

Рефрактометр
Применяется при
анализе пищевой
продукции на
содержание в ней
углеводов, спиртов,
жирных кислот и
т.д.

34.

Контроль качества напитков
Проба:
-----Стандарт
-----Апельсиновый
сок
Колонка: REZEX RCM
Детектирование: RI
Элюент: H2O
Расход: 0,5 мл\мин
Температура:
70 градусов
1. Сахароза
2. Глюкоза
3. Ксилоза
4. Фруктоза

35. Рефрактометр

Детектор по
светорассеянию
Принцип действия детектора:
измерение рассеяния света
микрочастицами компонента,
образовавшимися в результате
превращения под действием газа
элюата с колонки в мелкий аэрозоль и
его последующего испарения.
Отклик детектора не зависит от
способности анализируемого
компонента поглощать или излучать
свет и является функцией массы
анализируемого компонента,
введённого в детектор.

36.

37. Детектор по светорассеянию

Спектрофотометрические
детекторы
• Фотометры (светофильтры 217, 254, 263
и 279 нм)
• Спектрофотометры (дифракционная
решетка)
• Спектрофотометры с диодной матрицей
(дифракционные решетки,
интерфереционные фильтры, линейка
фотодиодов)

38.

Спектрофотометрические
детекторы

39. Спектрофотометрические детекторы

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ ДЕТЕКТОР
I0
Прямое
I
I0
Lg A l c
I
Косвенное

40. Спектрофотометрические детекторы

Устройство Z-ячейки для жидкостной
хроматографии
В слив
L = 10 мм, V = 2-20 мкл
Io
Кварцевое окно
I
Из колонки

41.

Применяют для:
Ароматических соединений (при 230-270 нм)
Гетероциклических соединений
Непредельных углеводородов
В-в, поглощающих в видимой области спектра

42.

43. Сигнал/шум, как параметр оптимизации чувствительности

fumaric acid
Анализ препарата
«Антипохмелин»
glucose
Колонка: Rezex ROA
100 мМ серной кислоты
0,8 мл/мин, 50 С
λ=190 нм
succinic acid
ascorbic acid
4005 mV
ch1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 мин

44.

Водорастворимые витамины
1200
1000
800
100
600
400
5
10
50
Биотин
1400
Расход: 1 мл/мин
A: 0.1%n-BuOH/0.1% TFA/H2O
B: AcN
3 мин изократика; 13 мин 0-50%В линейный
градиент
Детектор: 254 нм
Цианкобаламин
%В
Пиридоксин
mV
Аскорбиновая кислота
Никотиновая кислота
Колонка LUNA 5μ
C18(2)
200
0
ch2
%В
15
мин

45.

Водорастворимые витамины
%В
800
100
600
400
Цианкобаламин
1000
Никотиновая кислота
1200
Аскорбиновая кислота
1400
Биотин
Пиридоксин
mV
Колонка SYNERGI
4μ Hydro-RP
50
200
ch2
0
%В
5
10
15
мин
Расход: 1 мл/мин
A: 0.1%n-BuOH/0.1% TFA/H2O
B: AcN
3 мин изократика; 13 мин 0-50%В линейный
градиент
Детектор: 254 нм

46. Анализ препарата «Антипохмелин»

47.

Флуориметр
Технические характеристики
Источник светодиоды,
диапазон излучения 375±5 нм
Детектирующее устройство…фотоэлектронный
умножитель
(ФЭУ),
диапазон длин волн 405 - 600нм.
Сменные светофильтры в канале эмиссии
Объём ячейки, мкл ………………………..………………………………..................................1
Динамический диапазон …………………………………………………………………………..105
Уровень шума на пустой кювете при постоянной времени……... 0.5 сек, ОЕФ .2.5х10-5
Дрейф на пустой кювете (при стабильности температуры
среды +_ 1о С, при устойчивой работе от 2,5 до 3 часов), ОЕФ/час…………...... 2.5х10-5
Временная константа, с…………………………….…………………………………….. 0.1, 0.5 и 2
Выходы …………………………………..главный, 10мВ на полную шкалу,
вспомогательные…100мВ или 1В на полную шкалу

48.

ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИЙ ДЕТЕКТОР
I1, l = N nm
Iфлуор, l N +DN nm
I флуор K c
Высокая чувствительность ~ 10-12 г
Растворенный кислород может тушить флуоресценцию
Каждое вещество характеризуется своим квантовым
выходом излучения

49.

Применяют для :
• Полициклических ароматических
углеводородов
• Хинонов
• Производных аминокислот
• Некоторых витаминов (B2, B6 и др.)

50. Флуориметр

Шестнадцать ПАУ из списка приоритетных загрязнителей US EPA
1. Нафталин
(NAP)
2. Аценафтилен
(ACY)
7. Флуорантен 8. Пирен
(FLT)*
(PYR)
13. Бенз(a)пирен
(B(a)P)*
3. Аценафтен
(ACE)
4.Флуорен
(FLU)
5. Фенантрен
(PHN)
2
6. Антрацен
(ANC)
9. Бенз(a)антрацен 10. Хризен 11. Бенз(b)флуорантен 12. Бенз(k)флуорантен
(B(a)A)
(CHR)
(B(b)F)*
(B(k)F)*
14. Дибенз(a,h)антрацен
(D(a,h)A)
15. Бенз(ghi)перилен
(B(ghi)P)*
16. Индено(1,2,3-cd)пирен
(IND)*
* Шесть ПАУ из списка приоритетных загрязнителей ЕС

51.

Разделение смеси ПАУ на специализированной колонке YMC-PAH
Сигнал, ед. флуор.
225
Флуориметрический детектор ( переключение длин волн)
Детектор с диодной матрицей, l = 230 нм
NAP
200
ANC
175
B(a)P
150
D(a,h)A
125
B(k)F
B(b)F
FLU
ACE
100
PYR
75
PHN
50
CHR
B(ghi)P
B(a)A
FLT
ACY
IND
25
0
5
7.5
10
12.5
15
Колонка: YMC-PAH (150 4.0 мм, 5 мкм)
Элюент: вода/ацетонитрил, градиентный режим
Скорость потока: 1 мл/мин
Температура колонки: 30 °С
Объём пробы: 10 мкл
СПАУ = 0.1-2 мкг/мл
Сmin флуоресцирующих ПАУ = 0.02-0.8 нг/мл
Сmin (ACY) = 10 нг/мл пробы
17.5
20
22.5
t, мин
Программа градиента
Время, мин
Доля ацетонитрила, %
0
50
6
50
20
100
26
100
28
50
35
50
4

52.

Хроматограмма препарата
«Полиамин»
O
SR'
H
H
R'SH
H2NR
O
R’SH – серусодержащий
нуклеофил
Колонка: «Mightysil RP-18» (4.6х150 мм). Скорость потока 0.5 мл/мин.
Детектор –
флуориметрический (lвозб.=340 нм, lрегистр.=450 нм).
1=L-гистидин, 2=L-треонин, 3=глицин, 4=L-аргинин, 5=L-аланин, 6=L-валин,
7=L-метионин, 8=L-триптофан, 9=L-фенилаланин, 10=L-изолейцин, 11=Lлизин, 12=D-лейцин, 13=L-лейцин
N R

53.

Флуориметрический детектор
Применяется при анализе
пищевой продукции на
содержание в ней
микотоксинов,
бенз(а)пирена,
нитрозаминов,
жирорастворимых
витаминов и т.д.

54.

Амперометрический детектор
Цвет-Яуза
Анализ органических и неорганических
веществ, способных окисляться или
восстанавливаться на поверхности
рабочего электрода из стеклоуглерода,
золота, платины, серебра и других
материалов в диапазоне потенциалов
от минус 2 до плюс 2 В.
Технические характеристики:
Уровень флуктуационных шумов нулевого сигнала……………………..….. не более 0,25 нА
Предел детектирования Cmin , г/см3 по иодиду калия……………………………… 1х10-8
Потребляемая мощность……………………………………………………………. не более 10 В А
Габаритные размеры ………………………………………………………………..250 х 310 х 150 мм
Вес………………………………………………………………………………………………… 10 кг

55. Хроматограмма препарата «Полиамин»

Основные соединения,
определяемые амперометрическим детектором
Постояннотоковый режим
• Производные фенола и анилина, в том числе
биогенные амины (тирамин)
• Гидразин, гидроксиламин и их производные
• Меркаптан, тиомочевина и их производные
• Цианид, роданид, гидросульфид, арсенит
• Иодид, тиосульфат, сульфит, нитрит на уровне мкг/л
Импульсный режим
• Амины
• Основные типы сахаров

56. Флуориметрический детектор

МВИ № 57-05 Методика выполнения измерений массовой концентрации
1,1-диметилгидразина, гидразина, метилгидразина и тетраметилтетразена
в образцах природных вод методом ионной хроматографии
с амперометрическим детектированием
1,1-диметилгидразин
Метилгидразин
1,8 мкг/л
Гидразин
1 мкг/л
8 мкг/л
Компонент
Диапазон измеряемых
содержаний, мкг/л
Гидразин
1-800
Метилгидразин
2-1600
НДМГ
4-2000
ТМТ
10-4000
Тетраметилтетразен
8 мкг/л

57.

Общие правила эксплуатации
детекторов
• Заземление
• Не допускать попадания воздуха в ячейку
• Применяемая подвижная фаза должна давать
минимальный фоновый сигнал
• Уменьшение пульсаций базовой линии
• Термостатирование ячейки
• Контроль давления на ячейке! Ограничение по
скорости подачи подвижной фазы
• Работать в области линейного диапазона

58.

Быстрая жидкостная
хроматография
(UHPLC, RRLC, UPLC, RSLC)
• Диаметр зерна сорбента менее 2 мкм
• Меньшие размеры колонок
• Относительно большие потоки растворителя
Высокая эффективность
Малое время анализа
Высокое давление
Повышенные требования к системе

59. Разрешенные диапазоны изменения потенциалов относительно Ag/AgCl

Преимущества UPLC
0.25
AU
Скорость: 9X быстрее
Minutes
0.0
1.6
0.030
Чувствительность: 3X выше
0.025
AU
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
0.10
0.08
Разрешение: 1.7X больше
PC = 360
AU
0.06
0.04
0.02
0.00
0.0
5
10
15
20
25
30
35
Minutes
40
45
50
55
60

60.

Технические особенности
быстрых ВЭЖХ систем
• Короткие (30 – 50 мм) колонки с зерном менее 2 мкм малого
внутреннего диаметра (1 – 3 мм), большие потоки растворителя
(до 2 мл/мин)
• Необходимость использование высоких давлений (до 3000 Бар)
• Необходимость использования быстрых
автосемплеров (цикл ввод-промывка
менее 30 секунд)
• Необходимость использования
быстрых детекторов
(частота сбора данных 50 – 100 Гц)
• Минимизированный мертвый объем
системы (до 10 – 20 мкл!!!!)

61.

Пример определения флоксацинов
методом UHPLC

62. Общие правила эксплуатации детекторов

Повышение
характеристик
хроматографического
разделения
Core – Shell
технология

63.

64. Быстрая жидкостная хроматография (UHPLC, RRLC, UPLC, RSLC)

Преимущества жидкостной
хроматографии
• Более гибкие методы (многообразие вариаций подвижной
и неподвижной фаз, механизмов разделения)
• Лучше воспроизводимость (жидкости легче поддаются
стандартизации)
• Подходит для разделения полярных и неполярных веществ,
а также высококипящих и термонеустойчивых соединений
• Высокая чувствительность и более высокая точность
• Мощный метод изучения механизма метаболизма
веществ и т.п.