Факторы, губительно действующие на бактерий. Стерилизация, дезинфекция

1.

Факторы, губительно
действующие на бактерий.
Стерилизация, дезинфекция.
1

2.

Домашнее задание: Подготовка к коллоквиуму
Задание на занятие:
1. Внимательно изучить материал презентации.
2. Составить конспект по основным моментам
изучаемой темы (уделить особое внимание
методам изучения)
3. Просмотреть и зарисовать в тетрадь материал
представленный в разделе «Лабораторная
работа»
2

3.

Химические
Хлорамин
Н2О2
Кислоты: H2SO4, HCl
Щелочи
Спирт
J2, KMnO4
Газы: оксид этилена + бромистый метил (ОБ),
пропилен, SO2, формальдегид,
глутаральдегид, озон.
• Брильянтовый зеленый
3

4.

Физические
• Ультрафиолет
• Ультразвуковое излучение (для изготовления
вакцин – убивает микроорганизмы без
нарушения АГ-ой структуры
• Ренген (летальные дозы для микроорганизмов
очень высокие – вредны для человека)
• Инфракрасное излучение
• Высокая температура
• Низкая температура (-70 С и ниже)
4

5.

Биологические
• Нормобиота
• Метаболиты микроорганизмов:
антибиотики, молочная кислота
(лактобактерии)
• Секреты живых тканей: лизоцим, ИФ
• Растительный компонент (фитонциды)
• Бактериофаги
5

6.

Дезинфекция
• Комплекс мероприятий, направленных на
предотвращение распространения патогенных
микроорганизмов во внешней среде,
заражения ими пациентов и медицинского
персонала.
• Дезинфекция проводится с помощью
химического метода – дезинфицирующий
раствор должен иметь температуру не ниже 18
С.
• Экспозиция 1 час.
6

7.

Стерилизация
• Предстерилизационная обработка – цель,
удаление органических и неорганических
загрязнений.
• Стерилизация – комплекс мероприятий,
способствующих уничтожению м/о всех
видов, находящихся на разных стадиях
развития.
• Термин «стерильность» имеет абсолютное
значение. Нельзя сказать «относительно
стерилен» «почти стерильно»
7

8.

Термическая
Автоклавирование
Холодная
Излучение
Пастеризация
Газовая
стерилизация
Тиндаризация
Фильтрование
Кипячение
Сухожировой шкаф
Прокаливание в
пламени
Фломбирование
8

9.

Автоклавирование — это способ стерилизации, при котором действующим агентом является
насыщенный водяной пар при давлении выше атмосферного.
Пастеризация - способ обезвреживания молока, пива, соков и др. органических жидкостей
нагреванием до температуры ниже 100°С последующим быстрым охлаждением до +4 - + 6°С.
Различают низкую, или продолжительную (температура - 60 -70°С, экспозиция - 20 - 30 мин),
высокую, или кратковременную (71 -72°С, экспозиция - 5 - 60 с), мгновенную (90°С).
Кипячение - способ стерилизации, применяемый для обеззараживания шприцев
многоразового пользования, хирургических инструментов, резиновых трубок, стеклянной и
металлической посуды.
Дробная стерилизация (тиндализация). Дробная стерилизация применяется для
обеззараживания сред, разрушающихся под действием температур выше 100°С. Этот прием
был введен английским ученым Тиндалем. Принцип тиндализации заключается в том, что
прогревают среду или ее компоненты без избыточного давления несколько раз, и в период
между прогреваниями дают прорасти жизнеспособным спорам.
Фломбирование – прокаливание в пламени предмета, смоченного в спирте.
Стерилизация фильтрованием широко используется в микробиологической практике. Она
применяется для субстратов, не выдерживающих нагревания, например, для жидких сред и
растворов, содержащих термолабильные белки, витамины, сахара, некоторые антибиотики, а
также для сывороток, летучих веществ, например некоторых углеводородов и других. Способ
заключается в пропускании жидкостей через специальные мелкопористые фильтры,
называемые бактериальными. Микробные клетки задерживаются фильтрами главным образом
механически, поскольку они крупнее диаметра пор фильтра, а также потому, что поры идут
через фильтр чрезвычайно извилисто и на всём протяжении имеют разную форму и
неодинаковый размер.
9

10.

Сухожаровой шкаф (воздушный стерилизатор)
10

11.

Паровой стерилизатор – автоклав
11

12.

Антибиотики
• Вещества природного происхождения,
обладающие выраженной биологической
активностью. Они могут быть получены из
микроорганизмов, растений, животных
тканей и синтетическим путем.
12

13.

Диско-диффузионный метод
При определении чувствительности диско-диффузионным методом на
поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию
определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 по
McFarland) и затем помещают диски, содержащие определенное количество
антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны
подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в
термостате при температуре 35о-37оС в течение ночи учитывают результат путем
измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах.
Определение чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом.
13

14.

14

15.

Метод серийных разведений
Методы разведения основаны на использовании двойных
последовательных разведений концентраций антибиотика от
максимальной к минимальной (например от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д.
до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл). При этом антибиотик в
различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон)
или в агар. Затем бактериальную суспензию определенной плотности,
соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, помещают в
бульон с антибиотиком или на поверхность агара в чашке. После
инкубации в течение ночи при температуре 35о-37оС проводят учет
полученных результатов. Наличие роста микроорганизма в бульоне
(помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том,
что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его
жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост
микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию
антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не
определяется бактериальный рост принято считать минимальной
подавляющей концентрацией (МПК). Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл.
• Минимальная подавляющая концентрация (МПК) - наименьшая
концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая in vitro
полностью подавляет видимый рост бактерий
15

16.

16

17.

17

18.

18

19.

АБ – химиотерапевтические вещества
биологической природы (микробного, растительного
или животного происхождения) полусинтетического
или синтетического происхождения, которые в малых
концентрациях вызывают торможение размножения или
гибель чувствительных в ним микроорганизмов (или
опухолевых клеток во внутренней среде живого
организма).
Различают:
• Противобактериальные
• Противогрибковые
• Противопротозойные
• Противоопухолевые АБ
19

20.

Антибиотики, как таковые появились задолго до Флеминга (который
открыл пенициллин). Эволюционно антибиотики вырабатывались одними
бактериями против других в процессе конкуренции (соперничестве за
экологическую нишу, питательный субстрат и т.д).
• По действию антибиотики можно разделить на несколько групп в
зависимости от мишени их действия.
1) антибиотики, которые действуют на аппарат синтеза клеточной стенки
2) вещества действующие на фермент ДНК- гиразу (компактно
сворачивает ДНК и способствует расхождению цепей)
3) антибиотики нарушающие аппарат биосинтеза белка.
Взаимодействие АБ и МО основано на наличии у второго мишеней, т.е
структур на которые действуют АБ: повреждая клетки или блокируя
метаболизм.
• Как антибиотики воздействуют на свои мишени? Во-первых, мешают
взаимодействию молекул (конкурируют за нишу, в которую
встраивается молекула). Во-вторых, способствуют избыточному
действию. В-третьих, делают ошибки (бактерицидное действие).
• Природная устойчивость к АБ: связана с отсутствием таких мишеней,
малой доступностью мишени для АБ, слабым сродством АБ и МО.20

21.

Мишени действия АБ чаще бывают:
• Клеточная стенка (особенно ее ПГ)
• ЦПМ (пермиазы или другие ферменты)
• Рибосомы
• Митохондрии
• Генетические структуры или отдельные этапы связывания белка, НК, липиды.
Классификация антибиотиков по механизму действия
21

22.

Бактериофаги
• Вирусы бактерий – распространены повсеместно.
Неинфекционные фаги (вегетативные = незрелые)
находятся в стадии развития
Инфекционные фаги (способны вызывать
инфекцию)
• Покоящиеся (находятся вне клетки)
• Вирулентные (способны вызывать продуктивную
форму инфекций)
• Умеренные ( способны вызывать не только
продуктивную, но и редуктивную инфекцию)
22

23.

• Продуктивная инфекция – фаг размножается в
клетках и выходит из них.
• Редуктивная фаза – генома фага проник в
геном клетки, но не размножается, а
интегрируется в геном хозяина, становится его
частью. Такой фаг называется профаг, а клетка
называется лизогенной, т.к фаг, передающийся
по наследству может выйти
• Абортивная инфекция – взаимодействие фага
и клетки обрывается, на какой либо стадии
жизненного цикла фага и он погибает
23

24.

Применение бактериофагов
1. Диагностика заболевания для идентификации
выделенной культуры, т.к бактериофаг обладает
специфичностью. Используют чашечный метод и
пробирочный.
2. Фаготипирование – для определения фаготипа 1ого и
того же микроорганизма.
Фаготипирование используют также для выявления
источника и путей распространения инфекции
(эпидемиологическое маркирование). При этом
выделение бактерий одного фаговара от разных больных
указывает на общий источник их заражения.
3. Лечение
4. Генная инженерия
24

25.

Взаимодействие фага с бактериальной клеткой
После проникновения фага в бактериальную клетку возможно два пути их
развития: литический и лизогенный. В связи с этим по характеру
взаимодействия с бактериальной клеткой различают вирулентные и
умеренные фаги. Вирулентные фаги проникают в бактериальную клетку,
репродуцируются в ней и вызывают ее лизис (литический цикл).
Умеренные фаги, проникнув в бактериальную клетку, встраивают свою
ДНК в геном бактерии и в виде профага передаются по наследствуот
клетки к клетке, не вызывая лизиса бактерий (лизогенный цикл).
Жизненныйцикл вирулентного фага складывается из следующих стадий.
1.
Адсорбция бактериофага на клеточной стенке бактерий .
Адсорбция бактериофага на клеточной стенке бактерии.
В процессе адсорбции фаги прикрепляются своими жгутиками (фибриллами), шипами
или специфическими белками к фагоспецифическим рецепторам на клеточной стенке
бактерий. На бактериях без клеточной оболочки (протопластах, L-формах) фаги не
адсорбируются. Некоторые мелкие фаги в качестве рецепторов используют F-пили
бактерий
25

26.

2.
Проникновение нуклеиновой кислоты фага (инъекция, пенетрация)
внутрь бактериальной клетки.
Введение ДНК фага в бактериальную клетку.
После адсорбции происходит ферментативное расщепление клеточной стенки
лизоцимом, находящимся в дистальной части фагового отростка. Одновременно в
сократительном чехле бактериофага высвобождаются ионы кальция, которые
активируют АТФазу. В результате этого происходит сокращение чехла и вталкивание
стержня хвостового отростка через цитоплазматическую мембрану внутрь клеткиПри
этом капсид и отросток остаются вне клетки.
Около 10% фаговой ДНК активно впрыскивается внутрь клетки во время сокращения
чехла, а остальная часть ДНК втягивается в цитоплазму бактерии благодаря процессам
транскрипции и трансляции.
При адсорбции фагов на половых ворсинках проникновение нуклеиновой кислоты
происходит по каналу F-пили.
26

27.

3. Биосинтез компонентов фага внутри бактериальной клетки
Биосинтез компонентов фага.
Инъецированная нуклеиновая кислота вызывает перестройку метаболизма
бактериальной клетки: прекращается синтез бактериальных нуклеиновых кислот и
белков. В эту стадию ДНК бактериофага транскрибируется с помощью собственной
транскриптазы и образуется иРНК, которая поступает на рибосомы клетки-хозяина,
где синтезируются фаговые белки.
4. Сборка структурных компонентов фаговых частиц.
Сборка структурных компонентов фаговых частиц.
Вновь синтезированные белки в цитоплазме клетки формируют капсиды, отростки и
другие структуры дочерних фаговых частиц. После этого синтезированная
нуклеиновая кислота фагов заполняет пустотелые капсиды головок.
27

28.

5. Сборка (морфогенез) зрелых фаговых частиц
Сборка зрелых фаговых частиц.
6. Выход фаговых частиц из клетки
Выход фаговых частиц из клетки.
Вновь образованные фаговые частицы выходят наружу в результате
лизиса клеточной оболочки изнутри фаговым лизоцимом.
28

29.

ДНК умеренных фагов после проникновения в
цитоплазму встраивается в геном бактериальной
клетки. ДНК фага, встроенная в хромосому бактерии,
называется профагом, а культура таких бактерий –
лизогенной культурой.
Лизогенная культура бактерий.
29

30.

В лабораториях применяют несколько методов
выявления специфического действия фагов:
1.
Метод Отто (метод стекающей капли) используется для
идентификации неизвестных бактерий с помощью известных
диагностических фагов (фагоидентификация, фаготипирование). Для
выполнения этого метода на чашку с МПА наносится капля суточной
бульонной культуры и шпателем круговыми движениями распределяется по
поверхности агара. Затем наносится капля суспензии известного
бактериофага и наклоном чашки дают капле стечь по поверхности агара.
Посевы инкубируют в термостате в течение суток, после чего учитывают
результаты. При соответствии фага и бактерий в месте нанесения
диагностического фага наблюдается отсутствие роста культуры.
Фагоидентификация бактерий по методу Отто.
30

31.

Метод Фишера также используется для идентификации
неизвестных бактерий с помощью известных фагов. Для
выполнения этого метода каплю испытуемой суточной бульонной
культуры наносят на МПА и шпателем распределяют по
поверхности агара. Затем чашку условно делят на квадраты. В
каждый квадрат наносят по капле суспензий разных фагов. После
суточного культивирования в термостате учитывают результаты.
При соответствии бактерий и фага обнаруживаются зоны лизиса.
Фаготипирование бактерий по методу Фишера
.
31

32.

3.
Метод Фюрта также используется для типирования неизвестных
бактерий с помощью известных фагов. При выполнении этого
метода в расплавленный и остуженный до 45-50ОС МПА добавляют
суспензию известного бактериофага и тщательно перемешивают.
Полученную смесь разливают в чашки Петри. Каждую чашку
условно делят на несколько секторов, в которые высевают штрихом
исследуемые культуры. Чашки инкубируют в термостате, после чего
учитывают результаты. Рост культуры будет отсутствовать в том
секторе, в котором бактерии и фаг соответствуют друг другу.
Фагоидентификация бактерий по методу Фюрта.
32

33.

Лизис фагом в жидкой среде
(прозрачный бульон)
Роста нет
Лизис +
(мутный бульон)
Рост есть
Лизис 33

34.

Лабораторная работа № 8
34

35.

1. Просмотреть и зарисовать лизирующее действие
бактериофагов
Зарисовать лизис фагом на плотной питательной среде
35

36.

Зарисовать лизис фагом в жидкой среде
(прозрачный бульон)
Роста нет
Лизис +
(мутный бульон)
Рост есть
Лизис 36

37.

2. Зарисовать определение чувствительности
микроорганизмов к антибиотикам методом серийных
разведений и определить минимальную
ингибирующую концентрацию
37

38.

3. Зарисовать диско-диффузионный метод определения
антибиотикочувствительности микроорганизмов
38

39.

Дополнительные материалы (будет время
посмотрите):
1.https://www.youtube.com/watch?v=IAOyASt
EDdU
2.https://www.youtube.com/watch?v=HbBp675
RcPY&t=116s
3.https://www.youtube.com/watch?v=q277QSk
KMPI&t=251s
39