Лекция 4. Методы оптического имиджинга

1.

ЛЕКЦИЯ 4. МЕТОДЫ ОПТИЧЕСКОГО
ИМИДЖИНГА
доцент кафедры, к.ф.н. Завадский С.П.
Кафедра фармакологии
Института фармации
ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
(Сеченовский Университет)
Москва, Россия

2.

ВИДЫ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
https://avatars.mds.yandex.
net/getpdb/1946308/7395837aab33-4dfb-9d358da18b0820d1/s1200?web
p=false

3.

Виды фотовоздействия на биологические ткани
https://www.files.pimunn.ru/niibiomed/speckurs/optbio/turchin1.pdf

4.

Диагностика биотканей оптическими методами
В оптическом биоимиджинге используется видимый и ближний
инфракрасный диапазон длин волн (400-1300 нм)
https://teplov.com.ua/upload/Novosti/излучение.jpg

5.

ОПТИЧЕСКИЙ БИОИМИДЖИНГ
Оптический биоимиджинг – оптический метод исследования в видимой
и инфракасной областях спектра, изучающий функционирование живых
и растительных организмов на клеточном и молекулярном уровнях.
ПРЕИМУЩЕСТВА ОПТИЧЕСКОГО БИОИМИДЖИНГА
Неинвазивность (при разумных дозах излучения)
Высокое
пространственное
разрешение
(различные
виды
микроскопии)
Возможность визуализации на глубине (оптическая томография)
Возможность определения компонентного состава биологических
тканей (использование зондирующего излучения на нескольких
длинах волн)
Возможность использования оптических контрастов (специфическое
окрашивание)

6.

ОГРАНИЧЕНИЯ ОПТИЧЕСКОГО
БИОИМИДЖИНГА
СПОСОБНОСТЬ ПРОНИКАТЬ ВНУТРЬ ТОЛЬКО НА
НЕСКОЛЬКО САНТИМЕТРОВ
АБСОРБЦИЯ И ПОГЛОЩЕНИЕ СВЕТА

7.

Распространение света в биологических тканях
Рассеяние – фотон отклоняется от своего первоначального
направления
Поглощение – фотон поглощается,
выделяется тепло. При поглощении
короткого
светового
импульса
(наносекундного)
из
места
поглощения
распространяется
ультразвуковая волна
Флуоресценция – фотон
поглощается веществом
(флуорофором) и переизлучается
на другой длине волны
https://www.files.pimunn.ru/niibiomed/
speckurs/optbio/turchin1.pdf

8.

Рассеяние в тканях обусловлено
микронеоднородностями показателя преломления n
https://imgfotki.yandex.ru/get/9474/536547
59.2/0_9b990_3c026fe0_XL.jpg
Показатель
преломления (n)
Размер (µm)
Клетка
1.36 – 1.40
5 – 30
Ядро
1.39 – 1.47
3 – 10
Митохондрия
1.40 – 1.42
0.5 – 3

9.

СРЕДЫ
НЕРАССЕИВАЮЩИЕ (СЛАБО
РАССЕИВАЮЩИЕ)
СИЛЬНО РАССЕИВАЮЩИЕ
(рентгеновское излучение, оптическое
излучение в оптически прозрачных
объектах)
(оптическое излучение
практически во всех
биологических тканях)

10.

https://www.files.pimunn.ru/niibiomed/speckurs/optbio/turchin1.pdf

11.

Формирование оптического изображения
(оптический контраст)
Свойства биологических тканей
Рассеяние
Поглощение света
Зависимость оптических параметров от длины волны
Автофлюоресценция
Использование специфического окрашивания
Флюоресценция
Биолюминесцентные метки
Метки с высоким показателем поглощения/рассеяния

12.

13.

14.

Исследование внутренней структуры
биотканей оптическими методами
https://www.files.pimunn.ru/niibiomed/speckurs/optbio/turchin1.pdf

15.

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) позволяет
получать флуоресцентные изображения образцов биотканей с высоким
качеством с глубины до 200 микрон
Биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне
слабо, но благодаря применению ярких и разнообразных флуоресцентных
молекул (флуорофоров), способных специфически окрашивать разные
структуры тканей и клеток, метод флуоресцентной микроскопии оказался
очень ценным для медико-биологических исследований.
Устьица листьев
Охиа (Metrosíderos polymorpha)
https://fineartamerica.com/featured/1-leaf-stomata-ohialehua-tree-metrosideros-polymorpha-dennis-kunkelmicroscopyscience-photo-library.html
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/co
mmons/3/37/Book-hawaii-vtorov-104.jpg

16.

https://www.files.pimunn.ru/niibiomed/speckurs/optbio/turchin1.pdf

17.

18.

Флуоресцентная КЛСМ
https://www.files.pimunn.ru/niibiomed/speck
urs/optbio/turchin1.pdf
http://online.physics.uiuc.edu/courses/
phys598om/spring12/Lectures/files/Lec
ture%206%20confocal%202012.pdf

19.

Однофотонное (слева) и двухфотонное (справа) возбуждение.
(Штейн Г.И., 2007)

20.

Конфокальное изображение фрагмента монеты «1 евро»

21.

Сравнение широкопольной микроскопии и
конфокальной микроскопии
Поле подсветки
Функция
размытия точки
(ФРТ) – point
spread function
Широкопольная
микроскопия (widefield
microscopy)
Конфокальная
микроскопия
(confocal microscopy)
https://www.files.pimunn.ru/niibiomed/speck
urs/optbio/turchin1.pdf
http://online.physics.uiuc.edu/courses/ph
ys598om/spring12/Lectures/files/Lecture
%206%20confocal%202012.pdf

22.

Сравнение широкопольной микроскопии и
КЛСМ
Мышиный язык
Частицы пыльцы
Пыльца клена
Гиппокампус мозга

23.

Применение многофотонной КЛСМ в
медицинской диагностике
Диагностика различных кожных заболеваний, в том числе раннее
обнаружение злокачественных новообразований
Тканевая инженерия
Исследование применения косметических препаратов
Мониторинг действия лекарственных препаратов in situ
Исследования на лабораторных животных

24.

Дифракционный предел в конфокальной
микроскопии ограничивает разрешение метода
– световой луч нельзя сфокусировать в пятно
меньшего размера
https://www.files.pimunn.ru/niibiomed/speckurs/optbio/turchin1.pdf

25.

26.

Методы микроскопии сверхвысокого
разрешения позволяют «преодолеть»
дифракционный предел:
Stimulated emission depletion (STED)
Photoactivated Localization Microscopy
(PALM)
Stochastic Optical Reconstruction
Microscopy (STORM)

27.

STED-микроскопия (микроскопия на основе
подавления спонтанного испускания)
Klementieva N.V., Zagaynova E.V., Lukyanov К.А., Mishin A.S. The principles of superresolution fluorescence microscopy (review). Sovremennye tehnologii v medicine 2016;
8(2): 130–140, http://dx.doi.org/10.17691/stm2016.8.2.17.

28.

PALM микроскопия
PALM – photoactivated localization microscopy.
Изображение складывается из нескольких тысяч
последовательных кадров, в каждом из которых
возбуждается (активируется) не более 0,1-1%
флуоресцирующих молекул. Для каждой из
молекул компьютером восстанавливается
положение ее центроида.
Наиболее эффективное применение метода –
использование фотоактивируемых или
мерцающих с высокой частотой флуоресцентных
белков.
Ограничение метода – скорость переключения и
фотостабильность молекул.

29.

PALM микроскопия
PALM – photoactivated localization microscopy.
Наиболее эффективное применение метода – с
использованием фотоактивируемых флуоресцентных
белков. Один лазер используется для фотоактивации,
второй – для возбуждения флуоресценции и
обесцвечивания.

30.

PALM и обычная микроскопия
Фокальные контакты в фибробластах

31.

STORM микроскопия
Два лазера (зеленый/красный) и сближенные красители (Су3/Су-5) – длительность флуоресценции регулируется
переключением молекулы Су-5.
Запись широкопольного изображения идет со скоростью около
20 кадров в секунду на EMCCD камеру (время накопления
сигнала – около 40 мс, число квантов – от 600 до 3000). С
КМОП камерой – до 200 кадров в секунду.
Программа производит автоматическое восстановление
центроидов при случайном возбуждении отдельных молекул
флуорохрома. Достигнутая точность – около 25 нм.
Синтез полного изображения проводится по рассчитанным
центроидам (порядка 10000-30000 кадров).
Общее время получения одного кадра (оптического среза) –
около 2-20 минут.

32.

STORM микроскопия –
реконструкция во времени
Многократное сканирование образца позволяет постепенно
восстановить изображение микротрубочек в фиксированной клетке.
Краситель – Alexa-647. Формат кадра – 64х64 пиксела. Эквивалентный
размер пиксела – 140 нм. Частота сканирования – 1 кГц;
восстановлено точек излучения (молекул) – около 730 тыс.

33.

Определение положения
Две почти параллельные микротрубочки - с
помощью STORM (слева) и при обычной
микроскопии (справа)

34.

35.

STORM микроскопия, 3D
Сравнение обычного и STORM изображений
микротрубочек на краю клетки. Справа – увеличенное
изображение, на котором видны отдельные молекулы
в составе микротрубочек (3 проекции).

36.

3D-STORM микроскопия
Использование двух объективов позволяет
повысить разрешение в плоскости x-y до 10 нм, а
по оси z – до 20 нм. Высокое разрешение по оси z
достигается за счет использования

37.

Организация актиновых
филаментов в ламелле
3D STORM, 2 объектива. Nature methods, 2012

38.

39.

Красители для STORM и PALM

40.

PALM versus STORM
Два метода фундаментально схожи, так как основаны
на общем принципе – восстановлении положения
отдельных молекул за счет их кратковременной
флуоресценции.
Различия:
В PALM внешняя фотоактивация и фотообесцвечивание ограничивают свечение флуорофора. От белка
требуется лишь высокая фотостабильность.
В STORM случайные спонтанные переходы
флуорофора из светящегося в «темное» состояние
используются для того, чтобы различить соседние
молекулы. Поэтому от красителя требуется высокая
собственная частота мерцаний.