Культуры клеток, тканей и органов растений как основа БТ растений. Тотипотентность растительной клетки (лекция 6)

1.

План лекции
• Культуры клеток, тканей и органов растений
как основа БТ растений. Тотипотентность
растительной клетки.
• Общие требования к лаборатории. Условия
асептики при выполнении работ по
культивированию растений in vitro.
• Методы стерилизации растительного
материала при введении в культуру.
• Питательные среды для культивирования
растительных клеток и тканей in vitro.
• Регуляторы роста растений и их
использование для культивирования
растительных клеток и тканей in vitro.
• Физические условия культивирования клеток и
тканей растений

2.

Культуральный метод
• выращивание изолированных клеток,
различных тканей, частей и органов
растений в стерильных условиях на
искусственной питательной среде

3.

Культивирование клеток
• процесс, посредством которого in
vitro отдельные клетки (или единственная
клетка) прокариот и эукариот искусственно
выращиваются в контролируемых условиях.
• Культура клеток - относится в основном к
выращиванию клеток, относящихся к одной
ткани, полученных от многоклеточных эукариот,
чаще всего животных.
• Развитие технологии и методик выращивания
культур клеток неразрывно связаны с
выращиванием тканевых культур и целых
органов.

4.

Методы выделения клеток
• Из крови (но к росту в культуре способны
только лейкоциты).
• Из мягких тканей с помощью ферментов
(коллагеназа,
трипсин, проназа),
разрушающих внеклеточный матрикс.
• В питательную среду можно поместить
кусочки тканей.
• Культуры клеток, взятых непосредственно от
объекта (ex
(ex vivo),
vivo), называются первичными.

5.

Методы выделения клеток
• Большинство первичных клеток, за исключением
опухолевых,
имеют
ограниченную
жизнеспособность.
После
определенного
количества делений клетки такие стареют и
прекращают делиться.
• Существуют
иммортализованные
(«бессмертные»)
линии
клеток,
способные
размножаться
бесконечно.
У
большинства
опухолевых клеток эта способность является
результатом случайной мутациии, но у некоторых
лабораторных клеточных линий она приобретена
искусственно, путем активации гена теломеразы.

6.

Трансформация клеток
в культурах
• Способность перевиваемых клеток к
бесконечному размножению in vitro качественный скачок, в результате
которого клетки приобретают
способность к автономному
существованию,
существованию, подобно микроорганизмам.
• Совокупность изменений, приводящих к
появлению у клеток таких особенностей,
называют трансформацией,
трансформацией, а клетки
перевиваемых тканевых культур —
трансформированными.
трансформированными.

7.

Виды клеточных культур
( в зав-ти от техники)
I. Культуры переживающих
эксплантатов тканей
II. Культуры растущих тканей:
1) культуры фиксированных
кусочков ткани;
2) однослойные культуры
клеток:
а) первичнотрипсинизированные
(однократно культивируемые)
б) перевиваемые
в) полуперевиваемые культуры
(штаммы диплоидных клеток
человека и животных)
III. Суспензионные культуры
растущих клеток

8.

Объекты для
культивирования in vitro

9.

Культуральный метод:
получение двойных гаплоидов

10.

Каллусная ткань
• Ткань, возникающая путем
неорганизованного размножения
клеток эксплантов на поверхности
полутвердой питательной среды

11.

Суспензионная культура
• Отдельные клетки или агрегаты клеток,
выращиваемые в жидкой питательной
среде (во взвешенном состоянии)

12.

Однослойные культуры
Составляют основу современных технологий
выращивания вирусов и иммобилизованных
культур

13.

Преимущества
культуральных методов
• Простота клеточных моделей
• Отсутствие влияния других
частей организма
• Быстрое получение необходимой
биомассы в асептических условиях
• Контроль условий среды при
выращивании

14.

БТ на основе культур
клеток и тканей растений

15.

16.

Российская коллекция
клеточных культур (с 1982 г.)
• КК позвоночных. Ин-т Цитологии РАН (СПб)
• КК человека и животных для исследований в области
вирусологии. НИИ гриппа РАМН (СПб)
• КК позвоночных. НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского
РАМН
• КК позвоночных медицинского назначения.
Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций МЗ РФ
• КК с/х и промысловых животных. ВНИИ экспер. ветеринарии
им. Я.Р. Коваленко (Москва).
• КК человека от больных наследственными заболеваниями.
Медико-генетический научный центр, РАМН.
• КК беспозвоночных. Ин-т общей генетики РАН (Москва).
• КК высших растений. Ин-т физиол. высших растений РАН
• ККК генетически трансформированных высших растений.
Институт высших растений РАН

17.

Российская коллекция
клеточных культур (задачи)
• Непрерывное поддержание и развитие фондов коллекции
путем выведения, сбора, и хранения клеточных линий.
• Разработка единых требований к качеству
коллекционного материала, методов анализа, хранения и
контроля.
• Совершенствование методов ведения коллекции.
• Депонирование уникальных клеточных линий и гибридом,
патентируемых в связи с их практической ценностью.
• Создание информационных баз данных по КК.
• Обеспечение качественными КК научных исследований, а
также биологической и медицинской промышленности.
• Оказание научно-методической помощи специалистам
других учреждений страны по методам культивирования
и анализа КК

18.

Российская коллекция
клеточных культур (спектр)

19.

Стерильность
• Основное условие успешного
культивирования

20.

Стерилизация комнаты
• Тщательное удаление загрязнений
и пыли со всех поверхностей с
помощью мыльного раствора
• УФ-облучение

21.

Способы стерилизации
посуды

22.

Стерилизация
инструментов

23.

Стерилизация
питательных сред

24.

Соединения для
поверхностной стерилизации

25.

Техника поверхностной
стерилизации

26.

27.

28.

Физические факторы
культивирования
Условия освещения
Температура
Условия аэрации
Осмотическое давление
Газовая фаза и др…

29.

Выбор экспланта