РТГА, реакция нейтрализации, реакция торможения гемадсорбции

1.

РТГА, РЕАКЦИЯ
НЕЙТРАЛИЗАЦИИ, РЕАКЦИЯ
ТОРМОЖЕНИЯ
ГЕМАДСОРБЦИИ
Выполнил студент

2.

Реакция торможения гемагглютинации
• Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) - метод идентификации вируса
или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного,
основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом,
содержащим вирус, в присутствии иммунной к нему сыворотки крови.
• РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители
которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут
агглютинировать эритроциты различных животных.

3.

Основана на том, что антитела при встрече с гомологичным вирусом
(антигеном) нейтрализуют не только его инфекционную, но и
гемагглютинирующую активность, так как блокируют рецепторы
вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними
комплекс антиген + антитело.

4.

• Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке (лунке) смешивают равные объемы
сыворотки крови и вируса и после экспозиции (30—40 мин) добавляют эритроциты
соответствующего вида животного.
• Эритроциты являются индикатором наличия вируса в смеси. Агглютинация
эритроцитов указывает на наличие вируса в смеси, а отсутствие гемагглютинации
— на его отсутствие, так как антитела полностью нейтрализовали
гемагглютинирующую активность вируса.

5.

6.

Этапы постановки РТГА в парных
сыворотках

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

Этапы постановки РТГА для
определения типа вируса

14.

15.

16.

17.

18.

Реакция нейтрализации
• Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие
микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой
микробных антигенов антителами, т.е. их нейтрализацией.
• Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген - антитело
животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При
отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов
или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки
и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген - антитело.

19.

Реакция нейтрализации вирусов в
культуре клеток:
• А - цитопатогенный эффект
(ЦПЭ) в результате размножения
вирусов;
• Б - ЦПЭ отсутствует в результате
нейтрализации вирусов
антителами.

20.

• Компоненты: 1. Исследуемый вирус (при идентификации выделенною
вируса) или исследуемая сыворотка (при серодиагностике инфекции).
2. Диагностическая (группе-, видо-, типоспецифическая) сыворотка (при
идентификации вируса) или известный вирус — диагностикум (при
серодиагностике).
3. Индикаторный объект: животные, куриные эмбрионы, культуры тканей или
эритроциты.

21.

Так как для нейтрализации определенного количества вируса требуется определенное
количество антител, а один из этих компонентов все еще неизвестен, то PH можно
ставить в двух вариантах:
1) к разным дозам (разведениям) сыворотки (обычно в виде последовательных 2кратных разведений) добавляют одинаковые дозы вируса (обычно 100—1000 ЕД50). В
этом варианте определяют титр вируснейтрализующих антител в сыворотке,
показателем которого служит разведение сыворотки, защищающее от действия вируса
50 % зараженных биологических систем
2) к разным дозам (разведениям) вируса (обычно в виде последовательных 10-кратных
разведений) добавляют одинаковые дозы сыворотки (обычно в разведениях 1 : 10 или 1
: 20). При постановке данного варианта PH кроме исследуемой (или специфической)
сыворотки используют и нормальную (отрицательную) сыворотку. В этом случае
определяют индекс нейтрализации (IN), который показывает, во сколько раз иммунная
(специфическая) или исследуемая сыворотка снижает титр вируса по сравнению е
нормальной сывороткой.

22.

• Принцип. Смесью вирус (исследуемый или известный) + сыворотка
(диагностическая или исследуемая), эту смесь выдерживают при
соответствующей температуре (4, 22 или 37 °С) в течение одного часа или
16—18 ч (зависит от вируса и условий опыта), заражают культуру клеток,
куриный эмбрион или лабораторное животное. При (+) реакции, т.е. при
нейтрализации вируса антителами индикаторные объекты продолжают
нормально существовать, а в контроле — гибель или характерные изменения.

23.

Учитывают результат нейтрализации вируса по отсутствию:
1) гибели, развития клинической картины болезни и патологических изменений
в органах и тканях лабораторных животных;
2) гибели, патологических изменений в оболочках, тканях зародыша и
отсутствию гемагглютининов в жидкостях полостей куриных эмбрионах;
3) цитопатического действия (ЦПД) или бляшкообразования в культуре клеток.

24.

Реакция торможения гемадсорбции
(РТГАд)
• Эту реакцию используют в том случае, если
вирус обладает гемадсорбирующими
свойствами. Гемадсорбцией называется
адсорбция (прилипание) эритроцитов к
поверхности клеток, зараженных вирусом. Чаще
это явление наблюдают у гемагглютинирующих
вирусов. Так, гемадсорбирующими свойствами
обладают вирусы гриппа, вирус ПГ-3 и
некоторые штаммы парвовирусов крупного
рогатого скота и др.

25.

• РТГАд основана на торможении гемадсорбции, если зараженную вирусом
культуру клеток предварительно обработать специфической сывороткой
(содержащей антитела к этому вирусу).

26.

• Чтобы наблюдать гемадсорбцию, из
пробирки с зараженной вирусом культурой
клеток удаляют культуральную жидкость и
вносят 0,5%-ную взвесь эритроцитов (для
вирусов гриппа — эритроциты кур),
оставляют на 5—10 мин, затем слой клеток
споласкивают физиологическим раствором
(чтобы смыть эритроциты). Если в
зараженной культуре клеток идет
репродукция вируса, то на таких клетках
под малым увеличением микроскопа можно
видеть адсорбировавшие эритроциты, в
контрольных (незараженных) культурах
клеток таковые отсутствуют.

27.

Методика постановки РТГАд заключается в следующем: на 3—7-й день после
заражения культур клеток из них удаляют питательную среду, промывают
клетки раствором Хенкса и вносят в каждые 4 пробирки по 0,5 мл
специфической к вирусу сыворотки в разведении 1:10;
►пробирки в наклонном положении оставляют при комнатной температуре на
30 мин (для контакта клеток с антителами);
►во все пробирки вносят по 1 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов морской
свинки;
►через 30 мин — учет результатов.

28.

• Отсутствие гемадсорбции в пробирках со специфической сывороткой и
проявление ее в пробирках с зараженной культурой клеток, но не
обработанной специфической сывороткой, свидетельствует о наличии
вируса в культуре клеток.