Физиология микроорганизмов. Питательные среды. Культивирование микроорганизмов

1.

Физиология микроорганизмов. Питательные
среды. Культивирование микроорганизмов.

2.

Метаболизм микроорганизмов.
Катаболизм - распад сложных питательных
веществ на более простые называется
(энергетический обмен)
Анаболизм -Анаболизм-синтез компонентов
клетки (конструктивный обмен).

3.

4.

Механизмы поступления питательных
веществ в клетку
пассивная диффузия- по градиенту
концентрации, энергонезатратная, не имеющая
субстратной специфичности;
облегченная диффузия- по градиенту
концентрации, субстратспецифичная,
энергонезатратная, осуществляется при
участии специализированных белков пермеаз;

5.

Механизмы поступления питательных
веществ в клетку
активный транспорт- против градиента
концентрации, субстратспецифичен (специальные
связывающие белки в комплексе с пермеазами),
энергозатратный (за счет АТФ), вещества
поступают в клетку в химически неизмененном
виде;
транслокация (перенос групп)- против градиента
концентрации, с помощью фосфотрансферазной
системы, энергозатратна, вещества
(преимущественно сахара) поступают в клетку в
форфорилированном виде.

6.

7.

Основные химические элементы- органогены,
необходимые для синтеза органичеких
соединений- углерод, азот, водород, кислород.

8.

В зависимости от источника потребляемого
углерода микробы подразделяют на аутотрофы
(используют CO2)
и гетеротрофы (используют готовые
органические соединения).
Гетеротрофы, в свою очередь, разделяются на
сапрофитов (метатрофов), живущих за счет
органических соединений, поступающих в
бактериальную клетку из внешней среды
и паразитов (паратрофов), способных
утилизировать только продукты метаболизма
внутри живой клетки. Паразитизм может быть
факультативным и абсолютным или облигатным.

9.

В зависимости от источника энергии
микроорганизмы делят на
фототрофы (энергию получают за счет
фотосинтеза- например, цианобактерии)
и хемотрофы (энергия добывается за счет
химических, окислительно- восстановительных
реакций).

10.

Если при этом донорами электронов являются
неорганические соединения, то это
литотрофы,
если органические- органотрофы.

11.

Если бактериальная клетка в состоянии
синтезировать все необходимые для
жизнедеятельности вещества, то это
прототрофы.
Если бактерии нуждаются в дополнительных
веществах (факторах роста), то это
ауксотрофы.

12.

Дыхание микробов
Дыхание- биологический процесс переноса
электронов через дыхательную цепь от доноров к
акцепторам с образованием АТФ.
В зависимости от того, что является конечным
акцептором электронов, выделяют аэробное и
анаэробное дыхание.
При аэробном дыхании конечным акцептором
электронов является молекулярный кислород (О2),
при анаэробном- связанный кислород ( -NO3 , =SO4,
=SO3).

13.

Группы микроорганизмов по типам
дыхания
1.Облигатные (строгие) аэробы. Им необходим
молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания.
2.Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной
концентрации свободного кислорода.
3.Факультативные анаэробы могут потреблять
глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных
условиях.
4.Строгие анаэробы размножаются только в
анаэробных условиях т.е. при очень низких
концентрациях молекулярного кислорода, который в
больших концентрациях для них губителен.

14.

Способы создания анаэробных условий
1.Физический- откачивание воздуха, введение
специальной газовой безкислородной смеси
2.Химический- применяют химические
поглотители кислорода. В
3.Биологический- совместное культивирование
строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают
кислород и создают условия для размножения
анаэробов).
4.Смешанный- используют несколько разных
подходов.

15.

Система для анаэробного культивирования

16.

Анаэробная станция

17.

18.

Газогенерирующие пакеты

19.

Свечной сосуд

20.

21.

22.

Требования к питательным средам
1. Должны содержать необходимые для
соответствующих микробов питательные
компоненты в достаточном количестве;
2. Иметь адекватное значение величины рН,
изотоничность, степень насыщения кислородом
и быть стерильными, а по-возможности и
прозрачными.

23.

Для роста бактерий, кроме состава
питательной среды, имеют значение
кислотность среды,
аэрация,
температура,
свет и влажность.
Большинство бактерий растет при рН - 6.8-8,0,
то есть в нейтральной среде.

24.

Изотоничность питательной среды зависит от
содержания неорганических солей. Для
большинства бактерий изотоничной считается
среда, концентрация натрия хлорида в которой
составляет 0,5-0,6 %.

25.

Газовый состав среды
Облигатные аэробы нуждаются в постоянном
притоке молекулярного кислорода.
Облигатные анаэробы способны развиваться
только в отсутствии кислорода.
Большинство бактерий – факультативные
анаэробы, они растут как в присутствии
кислорода, так и без него.

26.

Для бактерий, культивируемых на плотных
питательных средах или в небольших объемах
жидких сред достаточно кислорода,
присутствующего в атмосфере.
Для культивирования бактерий – аэробов в
промышленных масштабах требуется
принудительная аэрация путем продувания
кислорода в реактор или ферментёр с культурой,
а для культивирования анаэробов - создание
безкислородных условий.

27.

Большинство известных микроорганизмов
относится к мезофилам, температурный
оптимум для которых лежит в интервале 25370С.
Термофилы способны расти при 45-900С,
психрофилы остаются жизнеспособными при 5 100 С.
Отклонение температурного режима от оптимального
неблагоприятно сказывается на жизнедеятельности
бактерий. Поэтому культивирование их осуществляют в
специальных шкафах – термостатах или термостатированных
комнатах, где поддерживается оптимальная заданная
температура.

28.

Патогенные для человека бактерии для
жизнедеятельности не нуждаются в освещении.

29.

Время выращивания (культивирования)
бактерий зависит от времени очередного
деления клеток данной популяции. Периоды
генерации большинства патогенных бактерий
составляют несколько (4-8) часов. Такие
культуры формируются в течение 18-24 часов.

30.

Клетки некоторых видов бактерий делятся с
большими временными интервалами, поэтому
увеличение численности популяций таких
культур происходит в течение длительного
времени, например, лептоспиры вырастают за
8-10 сут, микобактерии туберкулеза – за 3-4
недели.

31.

Классификация питательных сред
По происхождению среды бывают
естественными (натуральными) и
искусственными (синтетическими).

32.

К естественным средам относят те, в состав
которых входят продукты растительного или
животного происхождения. Они содержат все
компоненты, необходимые для роста и
развития бактерий, но имеют непостоянный
химический состав, то есть они нестабильны.

33.

Естественные питательные среды не пригодны
для изучения метаболизма бактерий, а
используются, в основном, для накопления
биомассы, поддержания культур бактерий в
жизнеспособном состоянии и для
диагностических целей, например, для
выделений чистых культур бактерий.

34.

К естественным средам относятся молоко,
кровь и сыворотка крови, отвары и экстракты
из природных субстратов, пептонная и мясная
вода, мясо-пептонные бульон и агар,
дрожжевые экстракты, картофельные, яичные и
желчесодержащие среды.

35.

Синтетические (искусственные) среды имеют
определенный химический состав и точное
количественное содержание питательных
веществ. Их используют для изучения
метаболизма бактерий, исследования
физиологии и биохимии микроорганизмов.

36.

Примером синтетической
среды могут служить среды
Козера и Симмонса,
используемые для изучения
способности бактерий
утилизировать цитраты. В
состав этих сред, наряду с
другими солями, входят
цитрат натрия и индикатор.

37.

В практике микробиологии, как правило,
используются комбинированные питательные
среды, в которых сочетаются естественные
компоненты с неорганическими солями.
Примерами таких сред являются агар Цейсслера, в
состав которого входит МПА, кровь и сахар, среды
Гисса, содержащие пептон, агар, один из сахаров и
индикатор, среда Раппопорта, состоящая из
желчного бульона, глюкозы и индикатора.

38.

39.

Классификация питательных сред
Среды можно по составу разделить так же на
простые и сложные.
К простым относятся мясная и пептонная вода,
мясо-пептонные бульон и агар.
Добавление к таким средам одного или
нескольких ингредиентов – углеводов, крови,
сыворотки и других составляющих делают их
сложными.

40.

Классификация питательных сред
По физическому состоянию питательные среды
могут быть жидкими, полужидкими и плотными.
Жидкие среды представлены, как правило,
водными растворами необходимых для жизни
веществ. Их используют для накопления биомассы,
обогащения культур бактерий, изучения
метаболизма.
Полужидкие и плотные питательные среды
получают из жидких, добавляя к ним агар-агар.

41.

Полисахарид агар получают из некоторых видов
морских водорослей, его высушивают и хранят в
виде пластин или порошка.
Бактерии не используют агар в качестве субстрата и
поэтому состав плотной питательной среды
зависит от состава жидкой среды, к которой
добавлен агар.
Агар плавится примерно при температуре 1000С и
застывает при 400С.
Концентрация агара для полужидких сред 0,5-0,7%,
а для плотных 1,5-2%.

42.

43.

Агаризированные среды разливают в пробирки
или чашки Петри в расплавленном состоянии, а
затем охлаждают.

44.

Сухие питательные среды представляют смеси
составляющих питательных сред определенного
состава. Перед использованием их растворяют в
воде в соответствии с инструкцией, указанной на
этикетке, устанавливают необходимое значение рН
и стерилизуют. Применение сухих питательных
сред облегчает работу по приготовлению сложных
сред в лабораториях.

45.

Классификация питательных сред
По целевому назначению питательные среды делят
на несколько групп:
основные или универсальные простые среды,
например, МПА, МПБ; на них могут расти многие
виды неприхотливых микроорганизмов;
специальные или сложные среды используют
для культивирования тех бактерий, которые не
могут расти на основных простых средах; в состав
специальных сред вводят, например, углеводы для
роста стрептококков, желчь для культивирования
сальмонелл, дефибринированную кровь для
дифтерийной палочки.

46.

Среди сложных сред можно выделить
избирательные или элективные среды. Они
предназначены для выделения и
культивирования определенного вида бактерий
из материала, содержащего большое
количество разных видов микроорганизмов.

47.

Разновидность элективных – селективные
питательные среды. В их состав входят не
только вещества, подавляющие рост отдельных
групп микроорганизмов, но и стимуляторы
роста отдельных видов бактерий.

48.

Дифференциально-диагностические среды
предназначены для идентификации бактерий
по биохимическим свойствам. В основе
использования этих сред лежат различия в
ферментативном составе бактерий и
способности ферментов расщеплять тот или
иной субстрат.

49.

Существуют среды для определения
гликолитической активности бактерий, в их
состав входят один (среды Гисса), два (среды
Ресселя) или три (среда Клиглера) сахара.
Протеолитическую активность бактерий изучают
на МПБ, средах с желатиной, свернутой сыворотке.
Возможность ферментировать более простые
азотсодержащие соединения изучают на
питательных средах с аминокислотами, бульоне с
мочевиной.

50.

Способность бактерий к выделению токсинов и
ферментов агрессии исследуют на кровяных
агарах, желточно-солевом агаре,
безсывороточном фосфатном агаре и других
подобных средах.

51.

Консервирующие среды используют для
транспортировки и хранения в течение
длительного времени материала, содержащего
бактерии. В их состав входят глицерин, хлорид
натрия и фосфатно-буферные растворы.

52.

Питательные среды стерилизуют в автоклавах
при разных режимах, которые зависят от
состава среды или, если питательные среды
содержат термолабильные компоненты, путем
стерилизующей фильтрации.

53.

Методы выделения чистых культур
бактерий
Чистой культурой называют такую культуру,
которая содержит микроорганизмы одного
вида.
Выделение чистых культур бактерий обязательный этап всякого
бактериологического исследования.
Чистая культура необходима для изучения
морфологических, культуральных,
биохимических и антигенных свойств, по
совокупности которых определяется видовая
принадлежность исследуемого
микроорганизма.

54.

Посев истощающим штрихом
Область применения:
для выделения чистых
культур из материалов,
содержащих обильную
смешанную
микрофлору.
Материал отбирают
петлей и на поверхности
плотной среды проводят
штрихи в таком
порядке, как указано на
рисунке. Перед каждым
новым нанесением
петлю стерилизуют в
пламени горелки.

55.

Техника посева

56.

Исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим
раствором или бульоном.
Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным
шпателем распределяют по поверхности среды.
Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой
же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на
шпателе остается все меньше и меньше,и при посеве на третью чашку
бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды
отдельно друг от друга.

57.

Посев на элективные среды: в ряде случаев
ЧИСТУЮ КУЛЬТУРУ можно получить, подавив
размножение части микробов факторами, к
которым выделяемый вид устойчив.
С этой целью используют
антимикробные препараты,
химические вещества
бактериофаги.
В питательную среду вносят соответствующее
вещество или фаг в строго определенной
концентрации, препятствующей размножению
сопутствующих бактерий, но не оказывающей
выраженного ингибирующего действия на
исследуемый микроорганизм.

58.

Обработка исследуемого материала
кислотой или щелочью: например,
микобактерии туберкулеза безразличны к
действию концентрированных растворов
минеральных кислот, в отличие от
остальных микробов, содержащихся в
мокроте

59.

Прогревание исследуемого материала при
80 "С в течение 20 мин для выделения
спорообразующих бактерий и уничтожения
неспорообразующих.
Споры бактерий при этом сохраняются и при
посеве прогретого материала на питательную
среду прорастают.
Если материал содержал только один вид
спорообразующих бактерий, таким образом
можно получить чистую культуру.
Если материал содержал споры разных
бактерий, дальнейшее выделение
осуществляют стандартными методами

60.

Метод Шукевича
применяется для получения
чистой культуры протея и
других
микроорганизмов,
обладающих
«ползущим»
ростом.
- Посев исследуемого материала
производят
в
конденсационную
воду
у
основания скошенного агара.
- Подвижные микробы (протей)
способны подниматься вверх
по
скошенному
агару,
неподвижные формы остаются
расти внизу на месте посева.
Пересевая
верхние
края
культуры, можно получить
чистую культуру.
-

61.

Метод Вейнберга: для
выделения чистых культур
облигатных анаэробов.
Разведения исследуемого
материала проводят в
расплавленной и охлажденной до
45-50 ° С агаризированной
питательной среде.
Делают 6-10 последовательных
разведений, затем среду в
пробирках быстро охлаждают и
заливают поверхность слоем
смеси парафина и вазелинового
масла, чтобы помешать
проникновению воздуха в толщу
питательной среды.