Кріозбереження рослинного матеріалу (лекція 8)

1.

Тема: Кріозбереження
рослинного матеріалу
1.
Кріозбереження рослинних клітин,
тканин, пагонів та зародків.
Технологічні прийоми кріозбереження
2.
Методи кріозбереження
3. Тести для визначення життєздатності
клітин
4. Банки генетичних ресурсів.

2.

Ефективним
способом збереження генофонду
рослин є консервація насіння або частин рослин
в умовах заморожування.
Для насіння достатніми умовами є температура
– 18-20˚C та вологість 3-7%, за яких зберігання
може здійснюватись протягом 50-100 років.
Найперспективнішим способом довготривалого
зберігання насіння є кріоконсервування і
зберігання його у парі рідкого азоту (- 160˚C)
або в рідкому азоті (- 196˚C).

3.

У генетичних банках ряду країн (Польші, Китаю,
Японії, США) надійним засобом зберігання
генофонду
рослин
є
кріоконсервація
–
зберігання за температури рідкого азоту - 196˚C.
За
таких умов можна призупинити ті генетичні
зміни, що настають під час тривалого
культивування клітин і тканин in vitro.

4.

На
сьогодні єдиним засобом необмеженого
зберігання штамів клітин, тканин, органів
рослин є кріозберігання.
Цим
терміном
позначають
складний
багатоетапний процес, який використовують
для тривалого зберігання у незмінному вигляді
живих клітин, тканин і органів у стані анабіозу.

5.

Основні етапи схеми кріозберігання:

Асептичне ізолювання і культивування рослинних
тканин;

Адаптація до низьких температур (за необхідності);

Попереднє культивування матеріалу на відповідному
живильному середовищі, доповненому кріпротекторами
протягом певного періоду;

Додавання кріпротекторів до зразків на підготовчій
стадії заморожування;

Контрольне охолодження і заморожування проб;

Зберігання в рідкому азоті;

Швидке розморожування рослинних тканин;

Відмивання кріопротекторів;

Повторне культивування відновлених тканин та
індукція їх регенерації.

6.

Кріобіологія
(від грецьк. kryos – холод, мороз, лід) –
розділ біології, який вивчає дію на живі системи низьких
та наднизьких температур (від 0 ºC до абсолютного нуля).
Кріостійкість
клітин, тканин і органів рослин, їх
природний та штучний захист від кріопошкоджень стає
актуальною проблемою з теоретичної і практичної точки
зору.
Це
пов’язано з необхідністю збереження генофонду
елітних, рідкісних і зникаючих рослин, а також клітинних
штамів-продуцентів,
які
складають
основу
біотехнологічних виробництв лікарських, харчових та
біологічно активних речовин.

7.

Термін
«кріозбереження»
застосовується
для
позначення складного багатоетапного процесу, метою
якого є обмежено тривале зберігання життєздатних
клітин,
меристем
або
органів
рослин
в
стані
вирішення
цієї
холодового анабіозу.
Єдиним
надійним
засобом
для
проблеми є глибокий холод (нижче -140ºС), який
забезпечує використання рідкого азоту (-196 ºС) або
його парів (-160ºС).

8.

Кріозбереження як система єдиного
екстремального процесу (заморожування –
зберігання – розморожування) складається з
таких етапів:
-
підготовка об’єкту,
додавання кріопротектора,
заморожування в певному режимі,
зберігання в рідкому азоті,
розморожування,
видалення кріопротекторів (відмивка),
рекультивація (для клітин),
регенерація цілих рослин.

9.

Заморожування
Цей процес відносно простий для об’єктів здуже низьким вмістом води
(пилок, насіння), які можна безпосередньо занурювати у рідкий азот і
проводити розморожування на повітрі у звичайних умовах.
Труднощі виникають при заморожуванні тканин або органів рослин
великого розміру.
Збереження життєздатності об’єктів за рахунок зниження фази рідкої води
забезпечується програмним заморожуванням у присутності кріопротекторів
з постійною малою швидкістю (0,3 – 1 град/хв) до -40 ºС. Присутність
кріопротекторів дозволяє вільній воді вийти з клітин і кристалізуватись вже
на поверхні у розчині.

10.

Кріопротектори – це речовини, які зв’язують вільну воду
як в міжклітинниках, так і в клітинах;
ускладнюють її кристалізацію за рахунок утворення з нею
водневих зв’язків;
зменшують
ущільнення
протопластів
клітин
при
заморожуванні.
Використовують
різноманітні речовини-кріопротектори:
диметилсульфоксид(ДМСО),
поліетиленгліколь(ПЕГ),
поліетиленоксид, етеленгліколь, гліцерин, сахарозу,
сорбіт, маніт, лактозу та ін.

11.

На сьогодні успішне кріозбереження клітинних і тканинних
культур ін вітро здійснено майже для 70 видів рослин,
половина з яких – меристеми.
Вченими
вже одержані рослини-регенеранти картоплі,
моркви, гороху, суниць, томатів з меристем, які
зберігались при наднизьких температурах.

12.

Заморожування бруньок і меристем
Кріозберігання генетичних ресурсів меристемами має
переваги порівняно з іншими способами.
Це пояснюється тим, що меристеми розвиваються
безпосередньо в рослини за умови забезпечення високої
генетичної стабільності, порівняно легко витримують
заморожування, оскільки складаються з дрібних клітин, в
яких немає вакуолей.
Для заморожування меристем найчастіше використовують
занурення в рідкий азот або заморожування з поступовим
охолодженням.
Результати роботи з меристемами гороху і полуниці
свідчать, що коли швидкість охолодження дорівнює 0,60,8˚C за 1 хв, зберігається достатньо висока
життєздатність – 95%, і після 8-26-тижневого зберігання у
рідкому азоті вона залишається на рівні 73%.

13.

Особливості заморожування культур клітин і
тканин.
Відповідні
зразки клітинних культур вміщують у
спеціальні ампули об’ємом 2 мл у стерильних
умовах. У них звичайно утримують 1 млн. клітин.
Спочатку
проводять повільне охолодження з
однаковою
швидкістю,
а
потім
поступове
заморожування під впливом низьких температур
одно- або багаторазово, потім застосовують
занурення в рідкий азот за температури - 196˚C.
Розморожування
здійснюють протягом 1-2 хв, за
умови, що пробірки погойдуються.

14.

Заморожування протопластів
Протопласти значно відрізняються від суспензії
клітин: у них відсутні клітинна стінка і
цитоплазматичний
зв’язок
із
сусідніми
клітинами.
Використовують суміш 5% диметилсульфоксиду
(ДМСО) і 10% глюкози.
Інші процеси не відрізняються від використаних
для культури клітин.

15.

Для визначення життєздатності
клітинних культур
використовують такі тести:
Фарбування флюоресциндіацетатом (ФДА);
лише живі клітини можуть зафарбовуватись ФДА
і флуоресціювати в ультрафіолетовому світлі.

2,3,5-трифенілтетразоліумхлоридний метод
(ТТХ). Клітини після виживання перетворюються
у формазон, що є червоною субстанцією,
нерозчинною у воді (розчиняється у разі
додавання етанолу).

16.

Фактори які впливають на життєздатність клітин
після кріозберігання:
Вид і фізіологічний стан культур перед
заморожуванням.
Наприклад ізольовані меристеми рослин, що у
природі
стійкі
проти
низьких
температур,
характеризуються більш високою життєздатністю
після розморожування ніж, наприклад тропічні.
Клітини після мітотичного поділу стійкіші проти
заморожування, ніж клітини, що знаходяться в
різних фазах мітотичного циклу.

17.

Вид кріопротекторів
Ступінь виживання рослин після зберігання у
рідкому азоті значною мірою залежить від
правильного добору і комбінування кріпротекторів.
Часто перед заморожуванням використовують
ДМСО,
аміномасляну
кислоту,
гліцерин,
різноманітні цукри, амінокислоти, які виконують
кріозахисну функцію.

18.

Швидкість охолодження
За
класичним
повільно
методом,
додають
до
охолоджені
кріопротектори
попередньо
охолоджених
відповідних культур.
Найуспішніше кріозбереження відбувається, коли зразок
повільно і поступово охолоджують зі швидкістю від одного
до кількох градусів Цельсія за 1 хв.

19.

Гранична температура охолодження зразків до
перенесення в рідкий азот.
Позитивні результати одержано при охолоджені
зразків
в
інтервалі
30-40˚C
за
1
год.
Вважається, що в цій температурній межі
дегідратування клітин оптимальне.

20.

Температура і швидкість розморожування.
Велика
частина
рослинних
тканин
зберігає
максимальну життєздатність у разі швидкого
розморожування на водяній бані за температури
40˚C, швидкість якого може дорівнювати від 10
до кількох сотень градусів Цельсія за 1 хв.
Відновлення клітин після розморожування.

21.

Фундаментальною
базою
для
збереження
генетичного складу рослин і його різноманіття є
колекції, тому в різних країнах світу інтенсивно
формують банки і бази даних рослин, які
об’єднують в єдину світову інформаційну
мережу.
Для збереження генофонду найнадійнішим є
створення банків генетичних ресурсів рослин
(генетичних банків).
На сьогодні у різних країнах світу функціонують
понад 1300 генетичних банків рослин.

22.

В Україні формування Національного генетичного банку рослин
розпочато у 1992 р. в Інституті рослинництва ім. В.Я. Юр’єва у
співдружності з Інститутом проблем кріобіології та кріомедецини
НАН України.
На сьогодні відпрацьовано умови кріоконсервації, зберігання та
відновлення життєздатності вегетативних частин, меристем
плодових, ягідних культур, картоплі, часнику;
насіння рослин зі зниженою здатністю до тривалого зберігання
(жита, сої, конопель, льону, цибулі, перцю, баклажанів;
пилку (жита, тритікале, кукурудзи, соняшнику, плодових
культур).
Розроблено обладнання для заморожування і розморожування,
для кріосховищ, підібрано оптимальні види контейнерів для
кріозбереження різних типів і кількостей рослинного матеріалу.