Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

1. Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

Московский государственный университет
им. М.В.Ломоносова
Химический факультет
Кафедра аналитической химии
Лаборатория биоаналитических методов анализа и оптических сенсорных систем
Видинчук Татьяна
Анатольевна
Студентка 6 курса
Руководитель
д.х.н., в.н.с. Беклемишев М.К.
Москва · 2023

2. Литературные данные

* Немодифицированный хлорофилл как флуориметрический реагент
предложено использовать С.А.Захаренковой и др. в 2021 г.
* Визуализация доставки гидрофильных соединений с использованием
карбоцианиновых флуорофоров предложена ею же.
* Не все карбоцианины коммерчески доступны.
* Карбоцианины обладают собственной токсичностью.
* Хлорофилл как флуорофор для визуализации доставки лекарственных
веществ не изучен.
2

3. Цели работы:

Использование хлорофилла как флуорофора для определения
лекарственных веществ и визуализации их доставки в
эукариотические клетки
Задачи работы:
• Показать возможность флуориметрического определения
цефтриаксона, блеомицина, винорелбина и метотрексата в воде
и искуственной моче в виде тройных агрегатов аналит –
краситель – противоион.
• Выбрать системы для визуализации доставки этих соединений с
использованием хитозанов и плюроников.
3
3

4. Методика. Схема визуализатора (из статьи) и соединения

* Экстракция смесью ацетона и гексана
* Удаление экстрагента испарением
* Растворение полученного сухого остатка в гексане
* Разделение смеси на фракции на колонке с кремнеземом
* Получены фракции:
* каротиноидов (желтая),
* безметальных хлорофиллов (феофитинов)(серая),
* хлорофиллов «а» и «b» (оттенки зеленого).
5

5. схему выделения хлорофила (из статьи)

* Экстракция смесью ацетона и гексана
* Удаление экстрагента испарением
* Растворение полученного сухого остатка в гексане
* Разделение смеси на фракции на колонке с кремнеземом
* Получены фракции:
* каротиноидов (желтая),
* безметальных хлорофиллов (феофитинов)(серая),
* хлорофиллов «а» и «b» (оттенки зеленого).
5

6. Спектры поглощения выделенных фракций

Выделенные фракции поглощают в различных областях спектра. Благодаря
этому нам удалось установить фракции хлорофилла «а» и «b».
6

7. Спектры флуоресценции выделенных фракций

Можно два на один слайд, не так размашисто
Хлорофилл а активно флуоресцирует, в то время как хлорофилл б не дает сигнала.
7

8. Выбор условий определения цефтриаксона

Так графики станут покрупнее
Условия определения
цефтриаксона и
получения тройных
агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
хлорофилл (разб) 30-40
мкл; фосфатный буфер
(рН=7,4) 30 мкл; вода до
300 мкл; ПГМГ (1 г/л) 60
мкл;ЦТАБ (0,01 м) 10
мкл; цефтриаксон (0,005
М в воде) 100 мкл.
8

9. Выбор условий определения бензилпенициллина

бензилпенициллина
метотрексата
Условия определения
и получения тройных агрегатов для
контейнеров (одни и те же) на 300 мкл:
хлорофилл (исходный раствор, полученный в результате …выделения хлорофилла (пункт
2.1.3), разбавленный в 3 раза) 10-20 мкл; фосф буфер (рН 7,4) 30 мкл; вода до 300 мкл;
ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл; бензилпенициллин (0,005 М) 150 мкл.
9

10. Сочетание???? хлорофилл-ПГМГ-ДДС

????
Почему мы тут должны это вдруг давать?
Флуоресценция тройного агрегата с блеомицином малостабильна, флуоресценция контроля
и тройного агрегата с блеомицином сразу после приготовления отличается почти вдвое,
однако в течение 10 минут практически исчезает.
10

11. Выбор условий определения блеомицина

Условия
определения
блеомицина и
получения тройных
агрегатов для
контейнеров на 300
мкл:
11
хлорофилл (разб в
3 раза) 10 мкл;
буфер бура (рН=8,5
или 9,2) 30 мкл;
вода до 300 мкл;
ПГМГ (1 г/л) 20
мкл; ДДС (0,008 м)
10 мкл; блеомицин
(0,005 М в воде) 10
мкл.

12. Определение винорелбина с ПГМГ и ДДС

Условия
определения
винорелбина с ПГМГ
и ДДС и получения
тройных агрегатов
для контейнеров на
300 мкл:
хлорофилл (разб) 15
мкл; фосфатный
буфер (рН=7,4) 30
мкл; вода до 300
мкл; ПГМГ (1 г/л) 20
мкл; ДДС (0,008 м)
15 мкл; винорелбин
(0,0093 М в воде) 10
мкл.
12

13. Определение винорелбина с ПГМГ и ЦТАБ

Два слайда по
винор - что
выбираем и
почему
Условия определения винорелбина с ПГМГ и ДДС и получения тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
хлорофилл (разб) 15 мкл; фосфатный буфер (рН=7,4) 30 мкл; вода до 300 мкл; ЦТАБ (0,01 м)
10 мкл; винорелбин (0,0093 М в воде) 10 мкл.
13

14. Возможность образования тройных агрегатов с одноименно заряженным ПАВ

Винорелбин способен образовывать тройные агрегаты как с катионными, так и с анионным
ПАВ (ЦТАБ и ДДС). Добавление ПГМГ в качестве коиона улучшает разницу
контроль/неконтроль.
14

15. Выбор условий определения метотрексата

Условия определения метотрексата и получения тройных агрегатов для контейнеров (одни и
те же) на 300 мкл:
хлорофилл (разб в 10 раз) 15-20 мкл; фосф буфер (рН 7,4) 30 мкл; вода до 300 мкл; ПГМГ (1
г/л) 20-40 мкл; ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл; метотрексат (0,005 М) 100 мкл.
15

16. Определение блеомицина в водном растворе

Воду всю на один слайд, мочу на другой
Предел обнаружения 1,1E-04 М
Общее число точек: 12
Линейный диапазон: от 1,1E-04 до 1,7E-04 М (2 точки)
16

17. Определение винорелбина в водном растворе

Предел обнаружения 3,4E-04 М
Общее число точек: 20
Линейный диапазон: от 3,4E-04 М до 6,5E-04 М (2 точки)
17

18. Определение метотрексата в водном растворе

Не уверен, что надо
показывать все
градуировки.
Может, пример дать. Или
все на один рисунок (4
рисунка на слайд)
Предел обнаружения 1,4E-04 М
Общее число точек: 12
Вот это все в общую табличку на
отдельный слайд. У вас она уже есть, но
менее подробная, можно расширить
Линейный диапазон: от 1,4E-04 М до 5,0E-04 М (3 точки)
18

19. Определение бензилпенициллина в водном растворе

Предел обнаружения 4,0E-05 М
Общее число точек: 15
Линейный диапазон: от 4,0E-05 М до 2,7E-04 М (4 точки)
19

20. Определение метотрексата в моче

Предел обнаружения 7,6E-04 М
Общее число точек: 14
Линейный диапазон: от 7,6E-04 М до 2,7E-03 М (5 точек)
20

21. Определение бензилпенициллина в моче

Предел обнаружения 1,0E-03 М
Общее число точек: 22
Линейный диапазон: от 1,0E-03 М до 1,2E-03 М (2 точки)
21

22. Получены флуоресцирующие тройные агрегаты хлорофилла а с аналитами и противоионом и показана возможность их использования для

Характеристики методик определения
лекарственных веществ воде и искусственной
моче
Аналит
Предел обнаружения в воде, М
Предел обнаружения в воде, М
блеомицин
1,1Е-04
-
винорелбин
3,4Е-04
-
метотрексат
1,4Е-04
7,6Е-04
пензилпенициллин
4,5Е-05
1,0Е-03
22

23. Эффект ко-иона в какой системе

в какой системе
ПГМГ является коионом по отношению к блеомицину, без ПГМГ тройные агрегаты
хлорофилл-ПАВ-блео флуоресцируют на уровне контрольного опыта (без блеомицина).
Флуоресценция возрастает в диапазоне концентраций ПГМГ (1 г/л) от 0 до 20 мкл.
Эффект коиона наблюдается только с блеомицином.
23

24. Контейнеры с цефтриаксоном для визуализации доставки

Слева: сшивка – глутар, после работали с немод. хит.
Справа – скрининг по полимерам для контейнеров с цефтриаксоном.
Не оч понятно, какой тут сухой остаток..
К ним еще размер и дзета..
24

25. Контейнеры с винорелбином для визуализации доставки

Изучаем контейнеры с плюрониками F-68 и F-127, несульфатированным и сульфатированным
малениированными хитозанами.
только контейнеры с карб. Хз сохраняют флуоресценцию после осаждения. При этом
контейнер с винорелбином дает сигнал выше контейнера
Без оногоДругие хитозаны дали слабо флуоресцирующий осадок, дающий сигнал на уровне
контрольного опыта.
25

26. Контейнеры с винорелбином для визуализации доставки

можно заменить токсичный ДДС на лаурат в ацетоне в случае тройного агрегата с
винорелбином и контейнеров с винорелбином и карб., мал. Сульф. Хз, плюроник F-68. Но
разгораются эти системы через сутки.
26

27. Контейнеры с метотрексатом для визуализации доставки

для контейнеров с метотрексатом в качестве полимеров подходят плюроники F-68 и F-127.
27

28. Выводы

…………
А фотографии где???
От ноября с ЦЕФ и последние