Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений
Литературные данные
Цель работы:
Методика. Схема визуализатора
Выделение хлорофилла из шпината
Спектры выделенных фракций
Структуры лекарственных веществ
Структуры ПАВ
Выбор условий определения цефтриаксона
Выбор условий определения бензилпенициллина
Выбор условий определения винорелбина
Выбор условий определения блеомицина
Зависимость сигналов от времени
Возможность образования тройных агрегатов с одноимённо заряженными ПАВ
Эффект коиона в системе хлорофилл-ПГМГ-ДДС-блеомицин
Выбор условий определения метотрексата
Определение лекарственных веществ в водном растворе
Определение метотрексата и бензилпенициллина в моче
- Показана возможность использования тройных агрегатов для определения - цефтриаксона, блеомицина, метотрексата, винорелбина,
Контейнеры с цефтриаксоном и метотрексатом для визуализации доставки
Контейнеры с винорелбином для визуализации доставки
Выбранные полимеры для получения контейнеров
Ковалентная сшивка контейнеров с винорелбином эпихлоргидрином
Стабильность флуоресценции тройных агрегатов и контейнеров с цефтриаксоном
Сохранение флуоресценции в тройных агрегатах с винорелбином
Сохранение флуоресценции в несшитых контейнерах с винорелбином
Устойчивость к диализу несшитых контейнеров
Методика работы с клетками аденокарциномы молочной железы человека
Результаты поглощения контейнеров клетками
Результаты эндоцитоза
Выводы
Спасибо за внимание!
4.97M
Категория: ХимияХимия
Похожие презентации:

Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

1. Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

Московский государственный университет
им. М.В.Ломоносова
Химический факультет
Кафедра аналитической химии
Лаборатория биоаналитических методов анализа и оптических сенсорных систем
Видинчук Татьяна
Анатольевна
Студентка 6 курса
Руководитель
д.х.н., в.н.с. Беклемишев М.К.
Москва · 2023

2. Литературные данные

• Хлорофилл – зелёный пигмент растений, доступный длинноволновый
флуорофор (λem=680 нм)
• Немодифицированный хлорофилл как флуориметрический реагент
предложено использовать С.А.Захаренковой и др. в 2021 г.*
• Визуализация доставки гидрофильных соединений с использованием
карбоцианиновых флуорофоров предложена ею же. **
• Не все карбоцианины коммерчески доступны.
• Карбоцианины обладают собственной токсичностью.
• Хлорофилл как флуорофор для визуализации доставки лекарственных
веществ не изучен.
* Zakharenkova S.A. e.a. ACS Sustain. Chem. Eng. 2021, 9, 3408.
** Zakharenkova S.A. e.a. Molecules, 2021, 26, 7426.
2

3. Цель работы:

Использование хлорофилла как флуорофора для определения
лекарственных веществ и визуализации их доставки в
эукариотические клетки
Задачи:
• Показать возможность флуориметрического определения
цефтриаксона, блеомицина, винорелбина, метотрексата и
бензилпенициллина в воде и искуственной моче в виде тройных
агрегатов аналит-краситель-противоион.
• Выбрать системы для визуализации доставки этих соединений с
использований хитозанов и плюроников.
3
3

4. Методика. Схема визуализатора

Схема устройства регистрации флуоресценции в БИК-диапазоне:
1 – фотокамера, оснащенная светофильтром, пропускающим излучение с длиной волны более 700 нм,
2 – одиннадцать последовательно закрепленных красных светодиодов с максимумом излучения 660
нм,
3 – алюминиевый радиатор для охлаждения светодиодов,
4 – 96-луночный планшет с образцами,
5 – светонепроницаемый кожух
5

5. Выделение хлорофилла из шпината

• Экстракция смесью ацетона и гексана (1:1 об.)
• Удаление экстрагента испарением
• Растворение полученного остатка в ацетоне
• Разделение смеси на фракции методом ТСХ
• Десорбция ацетоном
5

6. Спектры выделенных фракций

Длина волны поглощения, нм
Выделенные фракции распознавали,
сравнивая спектры фракций с
литературными спектрами «a» и «b».
Спектры флуоресценции
Интенсивность флуоресценции, усл. ед.
ед.
Интенсивность поглощения, усл.
Спектры поглощения
Длина волны флуоресценции, нм
Хлорофилл а флуоресцирует, а хлорофилл b – нет.
Далее использовали хлорофилл а.
6

7. Структуры лекарственных веществ

цефтриаксон
бензилпенициллин
метотрексат
блеомицин
винорелбин
7

8. Структуры ПАВ

ЦТАБ
ПГМГ
ДДС
лаурат
Для определения лекарственных веществ:
создание систем «хлорофилл-ПАВ-аналит»
с наибольшей разностью сигналов тройного агрегата и контрольного опыта
8

9. Выбор условий определения цефтриаксона

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с цефтриаксоном
от концентраций компонентов
Условия определения
цефтриаксона и получения
тройных агрегатов для
контейнеров:
• хлорофилл (разб) 30-40 мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (0,0056 М) 60 мкл;
• ЦТАБ (0,01 м) 10 мкл;
• Анализируемый раствор 100
мкл.
а) ПГМГ', б) цефтриаксона, в) ЦТАБ, г) времени.
'ПГМГ - Полигексаметиленгуанидин
9

10. Выбор условий определения бензилпенициллина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с
бензилпенициллина от концентраций компонентов
Условия определения
бензилпенициллина и получения
тройных агрегатов для контейнеров:
• хлорофилл (разб) 10-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• Анализируемый раствор 100 мкл.
а) природы ПАВ, б) бензилпенициллина.
10

11. Выбор условий определения винорелбина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с винорелбином от концентраций компонентов
Условия определения
винорелбина и получения
тройных агрегатов для
контейнеров:
• хлорофилл (разб) 15 мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• Анализируемый раствор 10
мкл.
а) ПГМГ, б) ЦТАБ', в)винорелбина, г) винорелбина и времени: измеряли
флуоресценцию каждой системы каждые 5 минут; Стандартные отклонения означают
колебания флуоресценции в течение часа.
'Цетилтриметиламмония бромид
11

12. Выбор условий определения блеомицина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с цефтриаксоном от концентраций компонентов
Условия определения
блеомицина и получения
тройных агрегатов для контейнеров:
• хлорофилл (разб) 10 мкл;
• буфер бура (рН=8,5/9,2) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (0,0056 М) 20 мкл;
• ДДС (0,008 м) 10 мкл;
• Анализируемый раствор 10 мкл.
а) рН, б) ПГМГ, в) ДДС', г) блеомицина, д) метанола.
‘ДДС – додецилсульфат натрия
12

13. Зависимость сигналов от времени

Агрегаты блеомицин–хлорофилл–ПГМГ–ДДС и контрольный опыт
• Сразу после приготовления сигналы различаются почти вдвое, однако через 7-10 мин
различие уменьшается.
• Измерять флуоресценцию систем, где присутствует подобное сочетание, необходимо сразу
после приготовления (системы с блеомицином и винорелбином).
13

14. Возможность образования тройных агрегатов с одноимённо заряженными ПАВ

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с винорелбином от природы ПАВ
• Винорелбин способен образовывать тройные агрегаты как с катионными, так и с
анионным ПАВ (ЦТАБ и ДДС).
• Добавление ПГМГ в качестве коиона улучшает разность сигнала и контрольного опыта.
14

15. Эффект коиона в системе хлорофилл-ПГМГ-ДДС-блеомицин

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с блеомицином от концентрации ПГМГ
• Без ПГМГ тройные агрегаты хлорофилл-ПАВ-блео флуоресцируют на уровне контрольного
опыта (без блеомицина).
• ПГМГ является коионом по отношению к блеомицину: флуоресценция возрастает в
диапазоне количеств ПГМГ (0,0056 М) от 0 до 20 мкл.
• Эффект коиона наблюдается только с блеомицином и винорелбином.
15

16. Выбор условий определения метотрексата

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с метотрексатом от концентраций компонентов
а) природы ПАВ, б) ПГМГ, в) ЦТАБ, г) метотрексата.
16
Условия определения
метотрексата и получения
тройных агрегатов для
контейнеров:
• хлорофилл (разб в 10 раз)
15-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (0,0056 М) 20-40 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• Анализируемый раствор
100 мкл.

17. Определение лекарственных веществ в водном растворе

Зависимость флуоресценции тройного агрегата от концентраций аналита:
а) блеомицина, б) винорелбина, в) метотрексата, г) бензилпенициллина.
а)
б)
в)
г)
17

18. Определение метотрексата и бензилпенициллина в моче

Зависимость флуоресценции тройного агрегата от концентраций
аналита: а) метотрексата, б) бензилпенициллина.
а)
б)
18

19. - Показана возможность использования тройных агрегатов для определения - цефтриаксона, блеомицина, метотрексата, винорелбина,

Характеристики методик определения лекарственных веществ
в воде и искусственной моче
В воде
Аналит
В моче
Предел
Общее число
Линейный
Предел обнаружения,
Общее число
Линейный
обнаружения, М
точек
диапазон, М
М
точек
диапазон, М
Блеомицин
1,1Е-04
12
(1,1-1,7)Е-04
-
-
-
Винорелбин
3,4Е-04
20
(3,4-6,5)Е-04
-
-
-
Метотрексат
1,4Е-04
12
(1,4-5,0)Е-04
7,6Е-04
14
(7,6-2,7)Е-04
4,5Е-05
15
(4,0-2,7)Е-05
1,0Е-03
22
-
Бензилпенициллин
19

20.

Контейнеры для визуализации доставки
лекарственных веществ
(полимер – лекарственное вещество – ПАВ –
хлорофилл)
20

21. Контейнеры с цефтриаксоном и метотрексатом для визуализации доставки

Зависимость флуоресценции от природы полимера контейнеров с а) цефтриаксоном б) метотрексатом
а)
б)
• Для контейнеров с цефтриаксоном в качестве полимеров выбраны немодифицированный,
карбоксиметилированный и малеинированный хитозаны.
• Для контейнеров с метотрексатом в качестве полимеров выбраны плюроники F-68 и F-127.
• Частицы: размер 10-1000 нм, дзета-потенциалы около 0 мВ.
21

22. Контейнеры с винорелбином для визуализации доставки

Зависимость флуоресценции контейнеров с винорелбином а) от природы полимера
б) природы полимера и осаждения
а)
б)
• Для получения контейнеров с винорелбином изучены плюроники F-68 и F-127,
несульфатированный и сульфатированный малениированные хитозаны.
• Только контейнеры с карбоксиметилированным хитозаном сохраняют
флуоресценцию после выделения осаждением.
• Другие полимеры дают осадок, флуоресцирующий на уровне контрольного опыта.
22

23. Выбранные полимеры для получения контейнеров

Аналит
Полимер
Немодифицированный хитозан
Цефтриаксон
Карбоксиметилированный хитозан
Малениированный хитозан
Метотрексат
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Винорелбин
Малениированный хитозан несульф.
Малениированный хитозан сульф.
Сокращения: хит. – хитозан; немод. – немодифицированный; карб. – карбоксиметилированный;
мал. – малеинированный; сульф. – сульфатированный; несульф. - несульфатированный
23

24. Ковалентная сшивка контейнеров с винорелбином эпихлоргидрином

Зависимость флуоресценции контейнеров
с винорелбином от природы хитозана
• В сшитых контейнерах с винорелбином и хитозанами нет
разности с контрольным опытом
• Переход к работе с несшитыми контейнерами
24

25. Стабильность флуоресценции тройных агрегатов и контейнеров с цефтриаксоном

Зависимость флуоресценции контейнеров от природы хитозана и времени
Изменение сигнала (относительно контрольного опыта) во временем (в течение двух суток):
- тройные агрегаты (без полимера): уменьшается
- несшитые контейнеры с немод. хитозаном: сохраняется
- сшитые контейнеры с немод. хитозаном: возрастает (выталкивание цефтриаксона сшивателем из
агрегатов)
25

26. Сохранение флуоресценции в тройных агрегатах с винорелбином

Зависимость флуоресценции контейнеров с винорелбином от природы ПАВ и времени
• Флуоресценция сохраняется в течение двух суток, если в качестве ПАВ использованы ПГМГ+ДДС или
лаурат в ацетоне
• В случае лаурата в воде разность с контрольным опытом появляется через сутки
• Принято решение далее работать с лауратом в воде (наименее токсичен)
26

27. Сохранение флуоресценции в несшитых контейнерах с винорелбином

Зависимость флуоресценции контейнеров с винорелбином от природы ПАВ, природы хитозана и времени
• Возможна замена токсичного ДДС на лаурат в ацетоне (в случае тройного агрегата с винорелбином и
контейнеров с винорелбином и карбоксиметилированным, малеинированным сульфатированным
хитозанами, плюроником F-68); Принято решение далее работать с ними
• В системах с лауратом флуореценция через сутки возрастает
27

28. Устойчивость к диализу несшитых контейнеров

Состав контейнера
Время диализа до разрушения контейнера
Аналит
полимер
ПАВ
Плюроник F-68
Лаурат

Плюроник F-127
Лаурат

Карб. хит.
ЦТАБ-ПГМГ
45 мин
Плюроник F-68
ЦТАБ-ПГМГ
10 мин
Плюроник F-127
ЦТАБ-ПГМГ
10 мин
Винорелбин
Метотрексат
Контейнеры с винорелбином и плюрониками устойчивы к диализу в течение 1 ч,
Контейнеры с метотрексатом и карбоксиметилированным хитозаном устойчивы к диализу в течение
45 мин
Разрушение контейнеров с метотрексатом и плюрониками начинается в течение 10 мин
Все изученные системы потенциально пригодны для доставки в клетки
28

29. Методика работы с клетками аденокарциномы молочной железы человека

Живые клетки сорбированы на дне лунок при 37˚С.
1) Промывка ячеек фосфатным буферно-солевым
раствором (PBS)
Ячейки для конфокального микроскопа
2) Заливание коллоидного раствора контейнеров
3) Инкубирование при 37˚С в течение 40 мин
4) Отбор раствора и промывка PBS
5) Фиксация (4%-формальдегид и выдерживание
без термостата 15 мин)
Работа с фиксированными клетками:
6) Промывка PBS
7) Заливка смеси глицерин – PBS (1:1 об.)
Фиксированные клетки могут храниться несколько
дней.
Далее исследование на конфокальном микроскопе.
29

30. Результаты поглощения контейнеров клетками

30

31. Результаты эндоцитоза

1) Контейнеры поглощаются клетками
2) Флуоресценция наиболее заметна в цитоплазме, на ядерной мембране
и в ядрышках ядра клеток. Доставка в ядро интересна для визуализации
доставки противораковых веществ
3) Сигнал контейнеров тройного агрегата выше, чем сигнал в отсутствие
аналита, это означает, что переносится именно контейнер с тройным
агрегатом.
31

32. Выводы

1. Получены флуоресцирующие тройные агрегаты хлорофилла а с аналитами и противоионом и показана
возможность их использования для определения цефтриаксона, блеомицина, метотрексата,
винорелбина, бензилпенициллина в водном растворе на уровне 0,1 мМ, а метотрексата и
бензилпенициллина – в искусственной моче на уровне 1 мМ.
2. Выявлено образование флуоресцирующего агрегата блеомицина с одноименно заряженным полимером
(блеомицин(2+) – полигексаметиленгуанидин(+) (ПГМГ) – додецилсульфат(–) – хлорофилл). В отсутствие
ПГМГ («коиона») флуоресценция агрегатов не отличается от флуоресценции контрольного опыта (без
блеомицина). Для ранее изученных модельных аналитов эффект «коиона» не наблюдали.
3. Взаимодействием тройных агрегатов (хлорофилла с модельными лекарственными веществами и
противоионами) с анионированными хитозанами или плюрониками получены контейнеры для
визуализации доставки цефтриаксона, метотрексата и винорелбина в эукариотические клетки.
4. Ковалентная сшивка контейнеров эпихлоргидрином не позволила получить устойчивого сигнала
модельных лекарственных веществ. Показана возможность длительного сохранения флуоресценции
выше сигнала контрольного опыта в тройных агрегатах без полиэлектролита и несшитых контейнерах
на основе карбоксиметилированного и малеинированного хитозана и плюроников F-68 и 128.
5. Показано сохранение флуоресценции контейнеров винорелбин – лаурат – плюроник F-68 (или F-128) во
время диализа против фосфатно-солевого буфера по крайней мере в течение 1 часа (в отличие от
аналогичных контейнеров с метотрексатом, ПГМГ и ЦТАБом, разрушающихся за 10 мин).
6. Показано проникнование контейнеров с винорелбином, цефтриаксоном и метотрексатом в клетки
аденокарциномы молочной железы человека с сохранением флуоресценции выше контрольного опыта.
Наблюдали распределение флуоресцирующих частиц в структуры цитоплазмы, ядерную мембрану и
ядрышко ядра.
32

33. Спасибо за внимание!

33
English     Русский Правила