Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

1. Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

Московский государственный университет
им. М.В.Ломоносова
Химический факультет
Кафедра аналитической химии
Лаборатория биоаналитических методов анализа и оптических сенсорных систем
Видинчук Татьяна
Анатольевна
Студентка 6 курса
Руководитель
д.х.н., в.н.с. Беклемишев М.К.
Москва · 2023

2. Литературные данные

• Хлорофилл – зелёный пигмент растений, доступный длинноволновый
флуорофор (λem=680 нм)
• Немодифицированный хлорофилл как флуориметрический реагент
предложено использовать С.А.Захаренковой и др. в 2021 г.*
• Визуализация доставки гидрофильных соединений с использованием
карбоцианиновых флуорофоров предложена ею же. **
• Не все карбоцианины коммерчески доступны.
• Карбоцианины обладают собственной токсичностью.
• Хлорофилл как флуорофор для визуализации доставки лекарственных
веществ не изучен.
* Zakharenkova S.A. e.a. ACS Sustain. Chem. Eng. 2021, 9, 3408.
** Zakharenkova S.A. e.a. Molecules, 2021, 26, 7426.
2

3. Цель работы:

Использование хлорофилла как флуорофора для определения
лекарственных веществ и визуализации их доставки в
эукариотические клетки
Задачи:
• Показать возможность флуориметрического определения
цефтриаксона, блеомицина, винорелбина, метотрексата и
бензилпенициллина в воде и искуственной моче в виде тройных
агрегатов аналит-краситель-противоион.
• Выбрать системы для визуализации доставки этих соединений с
использований хитозанов и плюроников.
3
3

4. Методика. Схема визуализатора

Схема устройства регистрации флуоресценции в БИК-диапазоне:
1 – фотокамера, оснащенная светофильтром, пропускающим излучение с длиной волны более 700 нм,
2 – одиннадцать последовательно закрепленных красных светодиодов с максимумом излучения 660
нм,
3 – алюминиевый радиатор для охлаждения светодиодов,
4 – 96-луночный планшет с образцами,
5 – светонепроницаемый кожух
5

5. Выделение хлорофилла из шпината

• Экстракция смесью ацетона и гексана (1:1 об.)
• Удаление экстрагента испарением
• Растворение полученного остатка в ацетоне
• Разделение смеси на фракции методом ТСХ
• Десорбция ацетоном
5

6. Спектры выделенных фракций

Длина волны поглощения, нм
Выделенные фракции распознавали,
сравнивая спектры фракций с
литературными спектрами «a» и «b».
Спектры флуоресценции
Интенсивность флуоресценции, усл. ед.
ед.
Интенсивность поглощения, усл.
Спектры поглощения
Длина волны флуоресценции, нм
Хлорофилл а флуоресцирует, а хлорофилл b – нет.
Далее использовали хлорофилл а.
6

7. Структуры лекарственных веществ

цефтриаксон
бензилпенициллин
метотрексат
блеомицин
винорелбин
7

8. Структуры ПАВ

ЦТАБ
ПГМГ
ДДС
лаурат
Для определения лекарственных веществ:
создание систем «хлорофилл-ПАВ-аналит»
с наибольшей разностью сигналов тройного агрегата и контрольного опыта
8

9. Выбор условий определения цефтриаксона

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с цефтриаксоном
от концентраций компонентов
Условия определения
цефтриаксона и получения
тройных агрегатов для
контейнеров:
• хлорофилл (разб) 30-40 мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (0,0056 М) 60 мкл;
• ЦТАБ (0,01 м) 10 мкл;
• Анализируемый раствор 100
мкл.
а) ПГМГ', б) цефтриаксона, в) ЦТАБ, г) времени.
'ПГМГ - Полигексаметиленгуанидин
9

10. Выбор условий определения бензилпенициллина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с
бензилпенициллина от концентраций компонентов
Условия определения
бензилпенициллина и получения
тройных агрегатов для контейнеров:
• хлорофилл (разб) 10-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• Анализируемый раствор 100 мкл.
а) природы ПАВ, б) бензилпенициллина.
10

11. Выбор условий определения винорелбина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с винорелбином от концентраций компонентов
Условия определения
винорелбина и получения
тройных агрегатов для
контейнеров:
• хлорофилл (разб) 15 мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• Анализируемый раствор 10
мкл.
а) ПГМГ, б) ЦТАБ', в)винорелбина, г) винорелбина и времени: измеряли
флуоресценцию каждой системы каждые 5 минут; Стандартные отклонения означают
колебания флуоресценции в течение часа.
'Цетилтриметиламмония бромид
11

12. Выбор условий определения блеомицина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с цефтриаксоном от концентраций компонентов
Условия определения
блеомицина и получения
тройных агрегатов для контейнеров:
• хлорофилл (разб) 10 мкл;
• буфер бура (рН=8,5/9,2) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (0,0056 М) 20 мкл;
• ДДС (0,008 м) 10 мкл;
• Анализируемый раствор 10 мкл.
а) рН, б) ПГМГ, в) ДДС', г) блеомицина, д) метанола.
‘ДДС – додецилсульфат натрия
12

13. Зависимость сигналов от времени

Агрегаты блеомицин–хлорофилл–ПГМГ–ДДС и контрольный опыт
• Сразу после приготовления сигналы различаются почти вдвое, однако через 7-10 мин
различие уменьшается.
• Измерять флуоресценцию систем, где присутствует подобное сочетание, необходимо сразу
после приготовления (системы с блеомицином и винорелбином).
13

14. Возможность образования тройных агрегатов с одноимённо заряженными ПАВ

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с винорелбином от природы ПАВ
• Винорелбин способен образовывать тройные агрегаты как с катионными, так и с
анионным ПАВ (ЦТАБ и ДДС).
• Добавление ПГМГ в качестве коиона улучшает разность сигнала и контрольного опыта.
14

15. Эффект коиона в системе хлорофилл-ПГМГ-ДДС-блеомицин

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с блеомицином от концентрации ПГМГ
• Без ПГМГ тройные агрегаты хлорофилл-ПАВ-блео флуоресцируют на уровне контрольного
опыта (без блеомицина).
• ПГМГ является коионом по отношению к блеомицину: флуоресценция возрастает в
диапазоне количеств ПГМГ (0,0056 М) от 0 до 20 мкл.
• Эффект коиона наблюдается только с блеомицином и винорелбином.
15

16. Выбор условий определения метотрексата

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с метотрексатом от концентраций компонентов
а) природы ПАВ, б) ПГМГ, в) ЦТАБ, г) метотрексата.
16
Условия определения
метотрексата и получения
тройных агрегатов для
контейнеров:
• хлорофилл (разб в 10 раз)
15-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (0,0056 М) 20-40 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• Анализируемый раствор
100 мкл.

17. Определение лекарственных веществ в водном растворе

Зависимость флуоресценции тройного агрегата от концентраций аналита:
а) блеомицина, б) винорелбина, в) метотрексата, г) бензилпенициллина.
а)
б)
в)
г)
17

18. Определение метотрексата и бензилпенициллина в моче

Зависимость флуоресценции тройного агрегата от концентраций
аналита: а) метотрексата, б) бензилпенициллина.
а)
б)
18

19. - Показана возможность использования тройных агрегатов для определения - цефтриаксона, блеомицина, метотрексата, винорелбина,

Характеристики методик определения лекарственных веществ
в воде и искусственной моче
В воде
Аналит
В моче
Предел
Общее число
Линейный
Предел обнаружения,
Общее число
Линейный
обнаружения, М
точек
диапазон, М
М
точек
диапазон, М
Блеомицин
1,1Е-04
12
(1,1-1,7)Е-04
-
-
-
Винорелбин
3,4Е-04
20
(3,4-6,5)Е-04
-
-
-
Метотрексат
1,4Е-04
12
(1,4-5,0)Е-04
7,6Е-04
14
(7,6-2,7)Е-04
4,5Е-05
15
(4,0-2,7)Е-05
1,0Е-03
22
-
Бензилпенициллин
19

20.

Контейнеры для визуализации доставки
лекарственных веществ
(полимер – лекарственное вещество – ПАВ –
хлорофилл)
20

21. Контейнеры с цефтриаксоном и метотрексатом для визуализации доставки

Зависимость флуоресценции от природы полимера контейнеров с а) цефтриаксоном б) метотрексатом
а)
б)
• Для контейнеров с цефтриаксоном в качестве полимеров выбраны немодифицированный,
карбоксиметилированный и малеинированный хитозаны.
• Для контейнеров с метотрексатом в качестве полимеров выбраны плюроники F-68 и F-127.
• Частицы: размер 10-1000 нм, дзета-потенциалы около 0 мВ.
21

22. Контейнеры с винорелбином для визуализации доставки

Зависимость флуоресценции контейнеров с винорелбином а) от природы полимера
б) природы полимера и осаждения
а)
б)
• Для получения контейнеров с винорелбином изучены плюроники F-68 и F-127,
несульфатированный и сульфатированный малениированные хитозаны.
• Только контейнеры с карбоксиметилированным хитозаном сохраняют
флуоресценцию после выделения осаждением.
• Другие полимеры дают осадок, флуоресцирующий на уровне контрольного опыта.
22

23. Выбранные полимеры для получения контейнеров

Аналит
Полимер
Немодифицированный хитозан
Цефтриаксон
Карбоксиметилированный хитозан
Малениированный хитозан
Метотрексат
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Винорелбин
Малениированный хитозан несульф.
Малениированный хитозан сульф.
Сокращения: хит. – хитозан; немод. – немодифицированный; карб. – карбоксиметилированный;
мал. – малеинированный; сульф. – сульфатированный; несульф. - несульфатированный
23

24. Ковалентная сшивка контейнеров с винорелбином эпихлоргидрином

Зависимость флуоресценции контейнеров
с винорелбином от природы хитозана
• В сшитых контейнерах с винорелбином и хитозанами нет
разности с контрольным опытом
• Переход к работе с несшитыми контейнерами
24

25. Стабильность флуоресценции тройных агрегатов и контейнеров с цефтриаксоном

Зависимость флуоресценции контейнеров от природы хитозана и времени
Изменение сигнала (относительно контрольного опыта) во временем (в течение двух суток):
- тройные агрегаты (без полимера): уменьшается
- несшитые контейнеры с немод. хитозаном: сохраняется
- сшитые контейнеры с немод. хитозаном: возрастает (выталкивание цефтриаксона сшивателем из
агрегатов)
25

26. Сохранение флуоресценции в тройных агрегатах с винорелбином

Зависимость флуоресценции контейнеров с винорелбином от природы ПАВ и времени
• Флуоресценция сохраняется в течение двух суток, если в качестве ПАВ использованы ПГМГ+ДДС или
лаурат в ацетоне
• В случае лаурата в воде разность с контрольным опытом появляется через сутки
• Принято решение далее работать с лауратом в воде (наименее токсичен)
26

27. Сохранение флуоресценции в несшитых контейнерах с винорелбином

Зависимость флуоресценции контейнеров с винорелбином от природы ПАВ, природы хитозана и времени
• Возможна замена токсичного ДДС на лаурат в ацетоне (в случае тройного агрегата с винорелбином и
контейнеров с винорелбином и карбоксиметилированным, малеинированным сульфатированным
хитозанами, плюроником F-68); Принято решение далее работать с ними
• В системах с лауратом флуореценция через сутки возрастает
27

28. Устойчивость к диализу несшитых контейнеров

Состав контейнера
Время диализа до разрушения контейнера
Аналит
полимер
ПАВ
Плюроник F-68
Лаурат
1ч
Плюроник F-127
Лаурат
1ч
Карб. хит.
ЦТАБ-ПГМГ
45 мин
Плюроник F-68
ЦТАБ-ПГМГ
10 мин
Плюроник F-127
ЦТАБ-ПГМГ
10 мин
Винорелбин
Метотрексат
Контейнеры с винорелбином и плюрониками устойчивы к диализу в течение 1 ч,
Контейнеры с метотрексатом и карбоксиметилированным хитозаном устойчивы к диализу в течение
45 мин
Разрушение контейнеров с метотрексатом и плюрониками начинается в течение 10 мин
Все изученные системы потенциально пригодны для доставки в клетки
28

29. Методика работы с клетками аденокарциномы молочной железы человека

Живые клетки сорбированы на дне лунок при 37˚С.
1) Промывка ячеек фосфатным буферно-солевым
раствором (PBS)
Ячейки для конфокального микроскопа
2) Заливание коллоидного раствора контейнеров
3) Инкубирование при 37˚С в течение 40 мин
4) Отбор раствора и промывка PBS
5) Фиксация (4%-формальдегид и выдерживание
без термостата 15 мин)
Работа с фиксированными клетками:
6) Промывка PBS
7) Заливка смеси глицерин – PBS (1:1 об.)
Фиксированные клетки могут храниться несколько
дней.
Далее исследование на конфокальном микроскопе.
29

30. Результаты поглощения контейнеров клетками

30

31. Результаты эндоцитоза

1) Контейнеры поглощаются клетками
2) Флуоресценция наиболее заметна в цитоплазме, на ядерной мембране
и в ядрышках ядра клеток. Доставка в ядро интересна для визуализации
доставки противораковых веществ
3) Сигнал контейнеров тройного агрегата выше, чем сигнал в отсутствие
аналита, это означает, что переносится именно контейнер с тройным
агрегатом.
31

32. Выводы

1. Получены флуоресцирующие тройные агрегаты хлорофилла а с аналитами и противоионом и показана
возможность их использования для определения цефтриаксона, блеомицина, метотрексата,
винорелбина, бензилпенициллина в водном растворе на уровне 0,1 мМ, а метотрексата и
бензилпенициллина – в искусственной моче на уровне 1 мМ.
2. Выявлено образование флуоресцирующего агрегата блеомицина с одноименно заряженным полимером
(блеомицин(2+) – полигексаметиленгуанидин(+) (ПГМГ) – додецилсульфат(–) – хлорофилл). В отсутствие
ПГМГ («коиона») флуоресценция агрегатов не отличается от флуоресценции контрольного опыта (без
блеомицина). Для ранее изученных модельных аналитов эффект «коиона» не наблюдали.
3. Взаимодействием тройных агрегатов (хлорофилла с модельными лекарственными веществами и
противоионами) с анионированными хитозанами или плюрониками получены контейнеры для
визуализации доставки цефтриаксона, метотрексата и винорелбина в эукариотические клетки.
4. Ковалентная сшивка контейнеров эпихлоргидрином не позволила получить устойчивого сигнала
модельных лекарственных веществ. Показана возможность длительного сохранения флуоресценции
выше сигнала контрольного опыта в тройных агрегатах без полиэлектролита и несшитых контейнерах
на основе карбоксиметилированного и малеинированного хитозана и плюроников F-68 и 128.
5. Показано сохранение флуоресценции контейнеров винорелбин – лаурат – плюроник F-68 (или F-128) во
время диализа против фосфатно-солевого буфера по крайней мере в течение 1 часа (в отличие от
аналогичных контейнеров с метотрексатом, ПГМГ и ЦТАБом, разрушающихся за 10 мин).
6. Показано проникнование контейнеров с винорелбином, цефтриаксоном и метотрексатом в клетки
аденокарциномы молочной железы человека с сохранением флуоресценции выше контрольного опыта.
Наблюдали распределение флуоресцирующих частиц в структуры цитоплазмы, ядерную мембрану и
ядрышко ядра.
32

33. Спасибо за внимание!

33