Редагування послідовностей ДНК у виноградної лози за допомогою Crispr

1.

Національний університет біоресурсів і
природокористування України
Факультет захисту рослин, біотехнологій та екології
Кафедра фізіології, біохімії рослин та біоенергетики
ДИПЛОМНА РОБОТА
НА ТЕМУ:
«РЕДАГУВАННЯ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ДНК У ВИНОГРАДНОЇ ЛОЗИ ЗА
ДОПОМОГОЮ CRISPR»
Виконала:
студентка IV курсу 1 групи
спеціальності «162 Біотехнології та
біоінженерія»
Гунько Тетяна Сергіївна
Науковий керівник:
д.б.н., проф.,
Прилуцька Світлана
Володимирівна

2.

Актуальність теми
• Борошниста роса є одним з найрозповсюдженіших патогенів
виноградної лози, особливо вразливими є сорти винограду,
котрі відносяться до виду Vitis vinifera. Застосування
фунгіцидів не є ефективним рішенням при боротьби з
патогеном, тому створення стійких сортів здатних
поєднувати одночасно якісні ознаки винограду та стійкість
до збудника є актуальним та відкритим питанням. CRISPR
(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
система
для
редагування
генному
є
ідеальним
інструментом, котрий може стати в нагоді при розробці
генетично стійких сортів рослин, адже схожі дослідження
були проведені для інших рослин і отримані результати були
цілком задовільними.
2

3.

• Робота виконувалась на базі дослідницької лабораторії підрозділу
AGAP науково-дослідницького центру CIRAD у Монпельє, Франція,
під керівництвом Valérie LAUCOU та Céline GEORGET.
3

4.

• Предмет
дослідження:
редагування
генному
виноградної лози за використанням системи CRISPR з
метою створення стійких сортів винограду до
борошнистої роси.
• Об’єкт дослідження: pegRNA для генів MLO 3 та MLO 6-
7.
• Методи
дослідження: біоінформатичні, молекулярні,
мікробіологічні, цитологічні.
• Мета
роботи: розробка та застосування PE техніки
редагування генному для генів MLO у виноградній лозі.
4

5.

Біологічні об’єкти
Для трансформації використовували ембріогенні калюси сортів V.
vinifera Grenache і Portan. Як вектор для трансформації Т-ДНК
використовували штам А4 Agrobacterium tumefaciens.
Штам top10 E. coli використовувався як тимчасовий господар під
час клонування, а DH5α – для розмноження плазмід ptwist.
Плазміди Ptwist GB-Dummy зі стійкістю до ампіциліну (AmpR) для
клонування GB із розробленою ДНК були синтезовані та замовлені
на сайті https://www.twistbioscience.com.
INRAE Versailles надав цільову плазміду (α1, α2, Ω1, Ω1R і Ω2) для
клонування GB.
5

6.

Методика виконання експерименту
• Дизайн pegRNA для конструкції prime editing CRISPR/CAS9 (були
використані сайти crispor.tefor та pegfinder.
Послідовності генів MLOs були взяті з хромосоми 8 NCBI Vitis
vinifera PN40024 для MLO3 (довідкова послідовність:
NC_012014.3) і хромосоми 13 для MLO6 і 7 (довідкова
послідовність: NC_012019.3), 12X.
• Плазміди були сконструйовані за використанням Golden Braid
клонувальної стратегії
• Ембріогенного
калюсу сортів Grenache та Portan були
трансформовані за допомогою Agrobacterium tumefaciens.
6

7.

Сконструйовані pegRNA для генів MLO 3 та MLO 6-7 PЕs
Індивідуальні частини відповідно до PEs
таргетів:
Гід – світло зелени, визначає розпізнавання
таргетів відповідно до генів MLO 3 та MLO 6/7.
RT теплет – жовтий, включає в себе бажані
мутації.
PBS – рожевий, сайт прив’язки.
Спільні частини для pegRNA
розробки та стабілізації:
esgRNA скафолд – голубий.
Лінкер – сірий (ТСТСТСТС).
EvopreQ1 – темно синій.
Також, були додані для спрощення GB клонування префікс (GCTT) та суфікс (CGCT ), котрі
відповідають за утворення липких кінців.
BsaI (GAGACC) кодуючі сайти містяться з обох кінців pegRNA послідовностей.
7

8.

Golden Braid клонувальна стратегія
8

9.

Карти кінцевих векторів pegMLO3 (1) та pegMLO6-7 (2) системи
клонування
1
2
9

10.

Трансформовані колонії бактерій, 25 мкл X-GAL (Blue-white screening)
Top 10 E.coli трансформовані бактерії гарячим шоком. Відібрані колонії обведені білим.
10

11.

Grenache калюс CBEs MLO конструкція через 3 тижні після трансформації
а - Grenache
Гігроміцин 1˟2
MLO
AUG
b - Grenache MLO
Хлорсульфурон 2 ˟1,25
AUG
c - Grenache MLO
Хлорсульфурон 2 ˟4
AUG
d - Grenache
Гігроміцин 3 ˟2
AUG
MLO
a, c та d – калюс у формі піків
11

12.

Висновки
• Було
проведено розробку та застосування CRISPR PE техніки редагування
генному для генів MLO 3, 6 та 7 у виноградній лозі.
• 1.
Використовуючи онлайн інструменти роботи з нуклеотидними
послідовностями - CRISPR-TEFOR та pegFinder було сконструйовано pegRNA для
таргетів генів MLO 3 і MLO 6-7.
• 2.
Було сконструйовано вектор, котрий складався з таких касет: Cas 9 – RT,
pegRNA ALS, pegRNA MLO віжповідно до гену, DSred та касету стійкості до
гігроміцину HygroR. Плазміда конструювалась за системою клонування
GoldenBraid.
• 3.
Ембріогенний калус сортів Grenache та Portan був трансформований
методом агробатеріальної трансформації. Через три тижня після
трансформації чашки з калусом Portan були контаміновані бактерією та були
виключені з подальшого дослідження. Калус Grenache продемонстрував
диференціацію тканин у вигляді піків за цей термін.
12

13.

Апробація результатів бакалаврської роботи
• 1. Гунько Т.С. ЗАСТОСУВАННЯ CRISPR СИСТЕМ
ДЛЯ БОРОТЬБИ З БОРОШНИСТОЮ РОСОЮ НА
ВИНОГРАДНІЙ ЛОЗІ. Міжнародна науковопрактична онлайн конференція, присвячена 60річчю спеціальності «Захист і карантин рослин»
«Інноваційні технології в захисті рослин за умов
глобалізації». - Київ. - 2022, - 135 с.
• 2.
Гунько Т.С. та Прилуцька С.В. РОЗРОБКА
ПІДХОДІВ РЕЗИСТЕНТНОСТІ ДО БОРОШНИСТОЇ
РОСИ У ВИНОГРАДНІЙ ЛОЗІ. ІІ Всеукраїнської
науково-практичної конференції здобувачів вищої
освіти, присвяченій 125-річчю НУБіП України
«Досягнення і перспективи в захисті та карантині
рослин». – Київ. – 2023, - 74 с.
13

14.

14