Мікроклональне розмноження

1.

ВИКОНАВ СТУДЕНТ ГРУПИ МАГ-11СПГ
КАПШІЄНКО

2.

Упродовж багатьох сторіч у сільському господарстві людство широко використовує вегетативне розмноження рослин (поділом куща,
живцями, відводками, листками, вусами та ін.), але цей процес – тривалий та трудомісткий. Завдяки біотехнології на сьогодні розроблено
принципово нові технології прискореного вегетативного розмноження майже для 2400 видів рослин, які одержали назву
«мікроклональне розмноження рослин» (розмноження рослин іn vitro, тобто у пробірці).
Основою мікроклонального розмноження є регенераційна здатність тотипотентних рослинних клітин.

3.

Термін «регенерація» (від лат. regeneratio – відновлення) – в біології означає відновлення організмом втрачених або пошкоджених
тканин (органів), а також відновлення цілого організму.
Із зоології відомо про природну регенерацію дощового черв’яка, гідри, планарії та ін., а у рослин висока регенераційна здатність
притаманна практично всім клітинам.

4.

Регенерацію рослин у культурі іn vitro можна здійснити такими шляхами:
Органогенез – утворення пагонів, коренів або рослин-регенерантів безпосередньо з експланту (апекса бруньки, листка, калусної
тканини та ін.);
Культура зародків (важливий засіб збереження нежиттєздатних зародків шляхом пророщування їх в умовах іn vitro, на штучному
поживному середовищі);
Соматичний ембріоїдогенез – утворення зародкоподібних структур із соматичних клітин рослин.

5.

Процес мікроклонального розмноження іn vitro може бути двох видів:
1.Активація розвитку уже присутніх у рослині меристем, які знаходяться у верхівках стебла, в пазухових (сплячих) бруньках.
2.Формування зародкоподібних структур заново (через калусну тканину).
На практиці найбільш поширений перший тип розмноження, що зводить до мінімуму появу генетично змінених форм рослин.
Органогенез при мікроклональному розмноженні рослин відбувається за таким сценарієм:
а) на штучне поживне середовище з певним балансом фітогормонів у контрольованих умовах температури й освітлення
вміщують невеличку частину рослини (бруньку, верхівку 0,3-3 мм), що пускає пагони;
б) пагони відділяють і пересаджують на інше середовище для укорінення;
в) одержані рослини-регенеранти адаптують до природних умов.

6.

Таким чином, мікроклональне розмноження (синонім – клональне мікророзмноження) – це масове нестатеве розмноження
рослин у стерильних умовах, яке виключає появу генетично змінених форм.
Технологія мікроклонального розмноження рослин складається з таких основних етапів:
1.підбір експлантів і введення їх у культуру;
2. активація розвитку пагонів з експланту при підвищеній концентрації цитокінінів живильного середовища;
3. укорінення пагонів при збільшеній концентрації ауксинів у поживному середовищі;
4.переведення отриманих рослин зі стерильних умов у ґрунт, їх адаптація (перенесення з умов іn vitro в умови іn vivo).

7.

Експланти, їх походження й введення в культуру.
Найбільш важливим моментом є вибір материнської рослини і експланта. Термін «експлант» застосовують для назви вихідного
шматочка рослини, який вводять у культуру іn vitro. В якості експлантів використовують верхівки пагонів, бокові бруньки, частинки
кореня або листка, черешок листка, суцвіття, пелюстки квітів, гіпокотиль проростаючого насіння та інші частини рослин.
Рис. 1. Схема мікроклонального розмноження рослин:
а – вихідна рослина;
б – різні типи експлантатів, які використовуються для мікророзмноження;
в – ті самі експлантати в культурі in vitro;
г – пряма регенерація рослин з існуючих в ізольованих експлантатах
меристем або з меристем які утворюються з диференційованих клітин
(наприклад, епідермісу) без виникнення калюсу;
д – регенерація рослин із калюсу шляхом органогенезу (за: Кунах, 2005).

8.

Для успішного проведення робіт із регенерації рослин вибір експлантів відіграє першорядне значення. Краще всього
використовувати матеріал, вилучений зі здорових, сильних рослин. Вибір експланта залежить від виду, стану рослини-донора, фази
її розвитку, сезону року. Значення має навіть положення експланта на рослині. Так, верхівки пагонів, взяті з верхніх гілок дерева,
мають більшу швидкість розмноження, аніж верхівки з нижніх гілок. Більшість експлантів добре вводяться в культуру у фазу
активного росту донорської рослини.
Проте є рослини, експланти з яких утворюють пагони лише у стані спокою. Незрілі, молоді органи завжди більш пластичні з точки
зору здатності до морфогенезу іn vitro, аніж старіючі, зрілі тканини та органи. Більше того, при виборі експлантів слід віддавати
перевагу меристематичним тканинам, оскільки вони легше виживають у культурі, мають більшу швидкість росту й тотипотентність.
Розмір експланта визначає також ступінь виживання іn vitro (крупніші за розміром верхівки пагона завжди краще виживають).

9.

Донорські рослини, з яких збираються вилучити експланти, вирощують у якомога чистішому середовищі, уникаючи надмірного
поливання, забруднення пагонів і листків. Важливими компонентами успіху є очистка і стерилізація рослинного матеріалу перед
введенням його в культуру іn vitro.
Таким чином, відібраний і простерилізований експлант вводиться в культуру на спеціальне поживне середовище.

10.

Активація розвитку пагонів та їх укорінення.
Усі рослини ростуть завдяки активності їх верхівкових меристем. Такі меристематичні тканини знаходяться на кінчику основного
пагона, у пазухових бруньках, зародку – класичних експлантах для мікроклонального розмноження рослин .
Брунька – це зачатковий, нерозвинений пагін з дуже вкороченими міжвузлями. Вона складається з меристематичної зачаткової
осі, яка закінчується конусом наростання. Нижче конуса наростання закладаються зачатки листків, різні за віком і розміром.
Листки розташовані в бруньці один над одним. У пазухах зачаткових листків (примордіїв) утворюються горбочки – зачатки бічних
(пазушних) бруньок. Отже, вегетативні бруньки можуть бути верхівковими (апікальними) і пазушними, розташованими в пазухах
листків або брунькових лусочок.
Поняття апекс і конус наростання не можна ототожнювати. Пояснюється це тим, що під конусом наростання розуміють лише
верхню (часто конусоподібну) частину апекса, де немає листкових зачатків (вище примордіальної зони) апекса. Тобто, під апексом
мається на увазі цілий комплекс меристематичних клітин з різними функціями. Апекс – це частина бруньки, ростовий центр пагона.
Завдяки діяльності його клітин формуються первинні тканини всіх органів, тобто йому властиві як гістогенні, так і органогенні
процеси.

11.

Таким чином, якщо наш експлант – верхівка пагона 0,25-0,30 мм у довжину, то в пазухах його зачаткових листочків знаходяться
додаткові меристематичні тканини, що здатні формувати нові пагони.
На другому етапі при підвищеній концентрації цитокінінів поживного середовища долається ефект апікального домінування в
умовах іn vitro і утворюється цілий пучок пагонів першого, другого, третього і т.д. порядку. Цей процес називається проліферацією
пагонів іn vitro.
Утворені пагони знову пересаджуються на те саме поживне середовище для подальшого одержання нових пагонів з його
пазухових бруньок. Подібний процес можна продовжувати й одержувати величезні кількості пагонів за відносно короткий період
часу.
Метод проліферації пазухових пагонів із апексів або бруньок є найбільш поширеним у практиці мікроклонального розмноження
різних видів рослин. При утворені пагонів поживне середовище повинно містити цитокінінів більше, аніж ауксинів. Це «золоте
правило пагоноутворення» має винятки для деяких видів рослин. У культурі іn vitro використовують такі цитокініни: кінетин,
зеатин, БАП; ауксини: ІОК, ІМК, НОК, 2,4-Д. Співвідношення цитокінін/ауксин підбирається для кожної культури
експериментально.

12.

Важливе значення для активації формування пагонів мають умови освітлення і температури. Світло необхідне для морфогенезу і
утворення хлорофілу. Використовують, як правило, люмінесцентні лампи з інтенсивністю світла 1000-1500 люкс. Оптимальним
періодом освітленості для більшості рослин вважають проміжок часу 16 годин, температура – 20-25 ºС.
Існує метод отримання пагонів із калусної тканини, що також належить до мікроклонального розмноження, але застосовується
мало, бо може призводити до генетичних змін у новостворених рослин-регенерантів.