Генетика развития растений. Меристемы растений

1.

Генетика развития растений
Развитие =
рост + дифференцировка
Развитие клетки,
ткани, органа
(морфогенез)

2.

Меристемы растений
Меристе́мы (с др.-греч. — «μεριστός» — делимый), или образовательные
ткани, или меристематические ткани, — обобщающее название
для тканей растений, состоящих из интенсивно делящихся и сохраняющих
физиологическую
активность
на
протяжении
всей
жизни
клеток,
обеспечивающих непрерывное нарастание массы растения и предоставляющих
материал для образования различных специализированных тканей.
Сейчас меристемы обычно рассматриваются как специализированные органы.
Общие свойства меристем:
1. Содержат пулы стволовых клеток (СК). По сути представляют собой
ниши СК, способные а). Поддерживать недифференцированное
состояние клеток и б). Продуцировать клетки, способные к
дифференцировке
Наличие центральной (ЦЗ) и периферических зон (ПЗ). ЦЗ состоит из
недифференцированных клеток (СК), ПЗ - из клеток-потомков СК,
вступивших на путь дифференцировки
2. Работа определенных групп ТФ, подавляющих дифференцировку
клеток. Обычно их гены экспрессируются в организующих центрах
(котоорые есть не у всех меристем)

3.

Меристемы растений
Апикальные меристемы (АМ)
Латеральные меристемым
Вегетативная АМ побега
Камбий
Перицикл
зачаток
листа
АМ соцветия
флоэма
камбий
кора
ксилема
Меристема цветка
стела Перицикл
зачаток
чашелистика
АМ корня
«Нерегулярные»
(дополнительные)
меристемы
Развиваются при
определенных условиях
Интеркалярные
меристемы
Меристемы
междоузлий
Меристемы
клубеньков
Раневой
каллус
Галлы и
опухоли

4.

Меристемы растений
Первичные - закладываются в эмбриогенезе
- SAM lineage
- procambium lineage
- RAM lineage
Вторичные – закладываются в постэмбриональном развитии
- xylem pericycle lineage
- phloem pericycle lineage
3

5.

Стволовые клетки в апикальных
меристемах побега и корня
АМ побега
SC – stem cells
стволовые клетки
АМ корня
OC / QC –
organizing /
quiescent center,
организующий
(покоящийся)
центр
5

6.

Определение стволовых клеток
Стволовые клетки (stem cells):
Делящиеся клетки, потомки которых либо остаются в том
же состоянии, что и материнские клетки (обычно
называемое «недифференцированным») и таким образом
пополняют популяцию стволовых клеток, либо
претерпевают дифференцировку и дают начало новым
органам и тканям.
Ниша стволовых клеток (stem cell niche):
локальное микроокружение, среда, поставляющая
факторы, необходимые для поддержания стволовых
клеток.
6
M. R. Tucker and T. Laux, TRENDS in Cell Biology 2007

7.

Организация ниши стволовых клеток
у животных и у растений
Ниша стволовых клеток
в яичнике Drosophila melanogaster
Ниша стволовых клеток в корне
Arabidopsis thaliana
Ниша стволовых клеток (stem cell niche):
локальное микроокружение, среда, поставляющая
факторы, необходимые для поддержания стволовых
клеток.
7
Scheres, NatRev. Mol Cell Biol (2007), V.8:345-354

8.

Общий принцип организации ниши стволовых клеток
дифференцированные клетки
ранние стадии дифференцировки
внутриклеточный
сигнал,
предотвращающий
дифферненцировку
недифференцированные клетки
«организующий центр»
(organizer)
8
Sablowski, Trends in Cell Biology, 2004,14(11):605-611

9.

Стволовые клетки:
1. Обладают высокой
потентностью
2. Способны к асимметричным
делениям (самоподдержание +
поставка клеток в зону
дифференцировки)
I
II
III
плюрипотентные
мультипотентные
олигопотентные
Клетки организующего центра
(«суперстволовые»):
1, 2. ++
3. Делятся ОЧЕНЬ медленно
4. Источник сигнала,
предотвращающего дифференцировку их самих и прилежащих клеток

10.

Асимметричное деление стволовых
клеток
Пополнение популяции
столовых клеток
Асимметричное деление
Стволовая
клетка
Дифференцированная
клетка
10

11.

Генетический контроль структуры и функции апикальной
меристемы побега
В отличие от животных, растения всю жизнь продуцируют новые
органы. Все постэмбриональное развитие – это результат
функционирования побеговой и корневой апикальных меристем
(ПАМ и КАМ).
11

12.

Строение апикальной меристемы побега
ПАМ
лист
узел
междоузлие
фитомер
12
Clark, Current Opinion in Plant Biology 2001

13.

Строение апикальной меристемы побега
1. Клональное разделение: L1 + L2 (туника), L3 (корпус)
2. Гистологическое разделение (зоны): центральная, периферические и риб-зона
CZ
(central
zone,
центральная
зона)
–
стволовые клетки (в т.ч.
организующий центр) и их
ближайшие потомки. Делятся
медленно, нет признаков
дифференцировки
RZ (rib zone, риб-зона) –
зона
закладки
проводящей
системы.
Растущие и делящиеся
клетки на разных стадиях
дифференцировки.
PZ
(peripheral
zone,
периферическая зона) –
дочерние
клетки
CZ.
Скорость и направление
делений
клеток
не
постоянно; клетки способны
13
к дифференцировке.

14.

«Симпластические поля» в апикальной меристеме побега
14

15.

Скорость прохождения клеточного
цикла в разных зонах ПАМ
Besnard et al., 2011

16. Распределение гормонов в ПАМ

16

17.

Взаимодействие факторов, регулирующих активность ПАМ
17

18. Изучение генетического контроля структуры и функции ПАМ методами классической («прямой») генетики:

Выявлены два классов мутантов, имеющих противоположный фенотип:
мутанты с
увеличением размера АМ
(clv1, clv2, clv3, fas1, fas2)
WT
clavata1
(clv1)
мутанты с
недоразвитием АМ
(stm, wus, zll);
wuschel
shootmeristemless
(wus)
(stm)
18

19.

Мутанты с недоразвитием АМ
WT
wus
stm
19

20.

Изучение взаимодействия генов STM и WUS:
1. Анализ фенотипа двойных мутантов stm wus
(метод классической, прямой генетики)
(«сильные» аллели wus и stm)
stm-5/+ x
wus-1/+
По генотипу
9 +/+
: 3 wus-1/+
:
3 stm-5/+ : 1 stm-5/ wus-1
По фенотипу
9 wt
: 3 wus-1
:
4 stm-5
stm-5 wus-1 = stm-5
эпистаз
Вероятно, гены осуществляют последовательные этапы одного
процесса:
продукт STM действует раньше, чем продукт гена WUS

21.

Изучение взаимодействия генов STM и WUS:
Анализ трансгенных растений с измененной экспрессией генов:
STM
WUS
Отсутствие изменений
в характере экспрессии
WUS (и CLV3)
ANT::STM
(эктопическая экспрессия
STM
в
листовых
примордиях)
WUS
35S::WUS-GR
(активация
экспрессии
WUS в меристеме)
STM
- Отсутствие изменений в
характере
экспрессии
STM и других
KNOX
генов,
- Активация экспрессии
CLV3
WUS и STM регулируют меристематическую активность клеток
независимо друг от друга
21

22.

Роль генов STM и WUS в апикальной меристеме побега
WUS
WUS
Поддержание пула
стволовых клеток в
меристеме
STM
STM
Пролиферация
стволовых клеток в
меристеме
22

23.

Мутанты по гену WUS (WUSCHEL)
дикий
тип
wus
-в эмбриогенезе АМ
образуется, но
уменьшенная, состоящая из
крупных вакуолизированных
клеток;
- АМ побега формирует
несколько листьев и
прекращает свое развитие;
- на придаточных побегах
могут закладываться цветки
с нормальным числом
чашелистиков и лепестков,
но преращающих развитие
с формированием
единственной тычинки
Mayer et al., Cell 1998
Гипотеза о функции гена WUS:
ген необходим для формирования нормальной АМ в эмбриогенезе,
для поддержания клеток ЦЗ апикальной меристемы в стволовом
состоянии в процессе вегетативного и репродуктивного развития. 23

24.

Мутанты по гену STM (SHOOT MERISTEMLESS)
stm-1, stm-5 - аллели с высокой
экспрессивностью мутантного признака
(«жесткие, суровые»):
-АМ не закладывается в эмбриогенезе;
-крупные вакуолизированные клетки между
семядолями (на месте меристемы);
-семядоли могут сливаться.
stm-2 – «мягкая, слабая» аллель:
-АМ с небольшим числом клеток
- Образует 1-3 листа и несколько побегов
из пазух листьев.
stm-6 – аллель с самой низкой экспрессивностью:
Мутанты цветут, но число органов цветка значительно меньше,
чем в цветках дикого типа.
Гипотеза о функции гена STM:
ген необходим для закладки АМ в эмбриональном
развитии, для предотвращения дифференцировки
клеток ЦЗ апикальной меристемы в процессе
вегетативного и репродуктивного развития.
24

25.

Мутанты с увеличенной АМ
WT
clv1
25

26.

Мутанты по генам СLV1, CLV2, CLV3 (CLAVATA)
Clavatus –лат. «булавовидный»
многолистная
розетка
фасциация
стебля
увеличение числа
органов цветка
увеличение числа
плодолистиков
Плод
«матрешка»
Гипотеза о функции генов CLV:
гены необходимы для ограничения размера
АМ в эмбриогенезе и на всех стадиях
постэмбрионального развития, а также для
ограничения пролиферации ФМ.

27.

Экспрессия генов STM, WUS, CLV1 и CLV3 в апикальной
меристеме побега
WUS – в ОЦ
CLV1 – в ОЦ и рядом с ним,
CLV3 – в L1, L2 над ОЦ
27

28.

Экспрессия генов STM и WUS в апикальной
меристеме побега
WUS
STM
Bowman J., Yuval E. Trends in Plant Science, 2000, V. 5., N. 3, pp. 110-115
28

29.

Гены семейств KNOX (STM) и WOX (WUS) кодируют
гомеодомен-содержащие транскрипционные факторы
Гены семейства KNOX арабидопсиса
Гены WOX у арабидопсиса и у других
растений
29

30.

Гомеодомен-ДНК - комплекс
Структура транскрипционного фактора с ДНК-связывающим гомеодоменом
N
вариабельный уч.
Гомеодомен ТФ
Pdx1
млекопитающих
гомеодомен
С
«Атипичный»
гомеодомен ТФ
30
WUS
арабидопсиса

31.

Экспрессия гена STM в АМ побега
Схема доменной организации белка STM
N
KNOX
GSE
ELK
HD
C
Выявление экспрессии гена STM на разных этапах развития АМ
методом гибридизации in situ
31
Moussian et al., The EMBO Journal 199

32.

Транспорт продуктов генов KNOX в апикальной
меристеме побега
32

33.

Нарушение
транспорта белка
STM вызывает
дефекты
развития ПАМ
Plant Journal, 2017

34.

ТФ BELL (тоже из семейства TALE) – партнеры ТФ KNOX
(обеспечивают транспорт KNOX в ядро)

35.

Мишени STM
Экспрессия гена AS1 (Asymmetric leaves1), отвечающего за развитие
листового примордия, у мутантов stm-1
дикий тип
stm-1
Взаимодействие STM
и AS1-AS2 в апексе
побега
35

36.

Модель эпигенетической регуляции генов KNOX в
дифференцированных клетках листьев
KNOX promoter
wt
as1
hira
Lodha et al., 2013

37.

STM активирует экспрессию гена CUC1
Гены CUC экспрессируются на
границе между листовым
примордием и меристемой
Spinelli et al., 2011

38.

Мишени STM в ПАМ
STM
STM
IPT (биосинтез цитокинина)
GA2ox (дезактивация гибереллинов)
38
Jasinski et al. 2005

39.

Мишени STM в ПАМ
Взаимодействие STM (генов KNOX) и генов, вовлеченных в метаболизм
цитокинина и гиббереллина в апексе побега
39
Jasinski et al. 2005

40.

Активация экспрессии KNOX важна для
формирования сложных листьев

41.

Транскрипционные факторы семейства WOX
клада «WUS»
гомеодомен
WUS-бокс (репрессия транскрипции)
«промежуточная»
клада
домен EAR
(рекрутирование
корепрессоров
трнаскрипции)
«древняя» клада
41

42.

Экспрессия гена WUS в АМ побега
Экспрессия
гена WUS в
организующем
центре
меристемы
Ядерная локализация
гибридного белка WUSGUS
(в клетках эпидермиса
лука)
42
Mayer et al., Cell 1998

43.

Усложнение организации
меристемы в ходе эволюции
высших растений и
сопровождается дупликацией
и последующей
«специализацией» генов
семейства WOX
Папоротники
линия
WOX13
линия
WOX9
WUS
Покрытосеменные растения
WOX5
WUS/WOX5
про-ортолог
линия
WUS
Голосеменные растения
Семенные растения
«современная» клада
Плауны
мхи
зеленые водоросли
Nardmann et al, 2009, 2012
WOX13
WUS/WOX9
про-ортолог
«древняя»
клада
WOX13
«промежуточная»
клада
WOX8/WOX9
43

44.

Роль про-ортолога WUS/WOX5 у голосеменных
растений
Геном Gnetum gnemon –
содержит про-ортолог
GgWUS/WOX5 (до дупликации
генов WUS/WOX5 в ходе
эволюции), экспрессирующийся
как в корне, так и в побеге
wt
pWUS-GgWUS/WOX5
Экспрессия pWUS-GgWUS/WOX5
у арабидопсиса обуславливает clvподобный фенотип (фасциация стебля,
формирование многочисленных цветков и
органов цветка)
Nardmann et al, 2009
44

45.

Взаимодействие WUS и системы
генов CLAVATA
clv1, 2, 3 WUS overexpression
многолистная
розетка
фасциация
стебля
увеличение числа
органов цветка
увеличение числа
Плод
плодолистиков
«матрешка» 45

46.

Регуляция экспрессии гена WUS в АМ с участием белков
CLAVATA
CLV3
CLV1
CLV2
CLV1 и CLV2 кодируют рецепторные белки (c
лейцин-богатым LRR–доменом), работающие в
виде гетеродимера CLV1/CLV2
CLV3 – лиганд 12 а/к, связывается
рецепторным комплексом CLV1/CLV2
46
с

47.

Взаимодействие WUS и системы генов CLAVATA
Дикий тип
Сверхэкспрессия CLV3
мутант CLV3
Гены-антогонисты - частое явление в генетике развития.
По-видимому, они позволяют осуществлять тонкую регуляцию
процессов развития.
47

48.

Взаимодействие WUS и системы CLAVATA
Увеличение домена
экспрессии CLV3 в
растениях ANT::WUS
WUS
дикий тип
мутант clv3
CLV3
CLV3
35S::CLV3
WUS

49.

Экспрессия генов CLV1, CLV3 и WUS в апикальной
меристеме побега
Экспрессия
WUS в ОЦ
CLV1 «защищает» ОЦ от негативного влияния CLV3, связывая его
49

50.

Рецепторные киназы растений c LRR–доменом
(Leucine-rich repeat receptor kinases)
Структура гена рецепторной LRR-рецепторной киназы
50
Haffani et al., Can. J. Bot. 2004

51.

Эксперименты по выявлению новых компонентов
сигнального пути, опосредованного CLV3
coryne (crn)
Muller et al., 2008
Получение новых мутаций на
фоне сверхэкспрессии CLV3
Известные рецепторы CV3 в ПАМ:
1. CLV1
2. CLV2+CRN
3. RPK2
CORYNE – рецепторная киназа с
коротким внеклеточным доменом
51

52.

CLV3 – член семейства CLE-пептидов
Тип:
В
TDIF
А
52

53.

Участие CLE-пептидов в развитии Arabidopsis
©2010 by American Society of Plant Biologists
Jun J et al. Plant Physiol. 2010;154:1721-1736

54.

Экспрессия CLE-пептидов в ПАМ
54

55.

Каким образом WUS регулирует поддержание запаса
стволовых клеток?
Стволовые клетки
WUS
55

56.

Белок WUS мигрирует в вышележащие слои центральной
зоны меристемы, где расположены стволовые клетки
Yadav et al., 2011
56

57.

ТФ WUS связывается с промотором гена CLV3 и
активирует его экспрессию
CLV3
WUS
WUS
TAAT
-1080 п.о.
Активация транскрипции
гена CLV3
TAAT
TAAT
Yadav et al., 2011
57

58.

Мишени ТФ WUS
Создание трансгенных растений с регулируемой (индуцибельной) экспрессией
WUS (WUS под контролем Et-OH-чувствительного промотора)
WUS
Транскрипционный
фактор
+ Et-OH
STM
LFY
Гены, используемые как контроли
alcR
Полномасштабный анализ экспрессии генов (microarray)
у трансгенных растений с активацией WUS (при добавлении Et-OH)
58

59.

WUS негативно регулирует экспрессию генов многих ТФ,
регулирующих дифференцировку клеток и развитие листа
Yadav et al., 2013

60.

Выявление мишеней ТФ WUS в транскриптомных
исследованиях
активация транскрипции
репрессия транскрипции
WUS
CLV1
ауксиновый
сигнальный
путь
цитокининовый
сигнальный
путь
60
Busch et al., 2010

61.

WUS негативно регулирует экспрессию генов
ARR А-типа (гены первичного ответа на цитокинин):
WUS
-1000 по
ARR7
61

62.

WUS негативно регулирует экспрессию генов LOG,
кодирующих цитокинин-активирующие ферменты
дикий тип
дикий тип+ЦК
Активность пролиферации
клеток ПАМ зависит от
баланса цитокининов и
CLV3. В центре этой
системы регуляции – ТФ
WUS
мутант clv3
мутант clv3+ЦК

63.

Биосинтез и сигнальный путь цитокининов:
роль WUS в их регуляции
WUS
WUS
63

64.

Взаимодействие транскрипционных факторов STM и WUS
и цитокининов
STM
AtIPT
цитокинин
RR B-типа
RR А-типа
Цитокининовый
ответ
WUS
GA20оксидаза
GA2оксидаза
Гиббереллин
Ауксиновый ответ
64

65. Роль гормонов в ПАМ

65

66.

Ауксины как регуляторы
формирования листовых
примордиев
DR5:GFP
66

67.

Модель взаимодействия ТФ и гормонов в развитии растений
Распределение
гормонов в
растительном
организме
Локальная
экспрессия
генов,
кодирующих ТФ
Локальное
изменение
концентрации
гормона (или
чувствительности
клеток к действию
гормона) в области
экспрессии ТФ
Изменение
параметров роста
растения

68.

Эпигенетическая регуляция экспрессии WUS
с участием факторов ремоделирования
хроматина

69.

Нарушение организации ПАМ у мутантов по генам FASCIATA
wt
fas1-1
wt
fas2-1
FAS1 и FAS2 кодируют субъединицы комплекса CAF-1 - (CHROMATIN
ASSEMBLY FACTOR-1) – шапероны гистонов H3/H4
Kaya et al., 2001

70.

При выжигании зон экспрессии
WUS или CLV3 они
восстанавливаются в
прилегающих клетках
существуют механизмы, определяющие экспрессию
этих генов в определенной зоне
before
WUS
CLV3
just after
2 days after

71.

Зоны экспрессии генов
в «модельной»
меристеме
Centering the Organizing Center in the Arabidopsis thaliana Shoot Apical Meristem by a
Combination of Cytokinin Signaling and Self-Organization (Adibi et al. 2016)

72.

Регуляции функции меристемы с участием
сигналов от дифференцированных клеток
ham (hairy meristem) – мутанты, характеризующиеся остановкой развития ПАМ и
дифференцировкой меристематических клеток (клетки слоя L1 в клетки
эпидермиса, нижележащие слои клеток – в клетки коры и проводящие ткани).
дикий тип
ham
(hairy meristem)
Дифференцировка
клеток меристемы
HAM
HAM - транскрипционный
фактор семейства GRAS
Stuurman et al., 2002
72

73.

Взаимодействие ТФ WOX и HAM в меристемах
ТФ WOX и НАМ
специфично
взаимодействуют в
меристемах:
• в АМ побега: WUS
с HAM1 и HAM2
•В АМ корня: WOX5
с HAM2
•В камбии:
WOX4 с HAM4
Zhou et al., 2015

74.

Филлотаксис
Золотое сечение (1,61803…)
Золотой угол (137,5°…) – «золотое сечение» окружности

75.

Модели филлотаксиса
«Ауксиновая» модель
«Механическая» модель
MAP4 (Microtubule Associated Protein4):GFP

76.

Взаимодействие факторов, регулирующих активность ПАМ
Giacomo et al., 2013

77.

Регуляция клеточного цикла растений
77