Семинарские занятия по общей генетике. Занятие 6

1.

Семинарские занятия по
общей генетике
Занятие 6
Методы
генной
инженерии

2.

Методы генной инженерии
1. Специфическое разрезание ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции
2. Амплификация участка ДНК
in vitro - ПЦР – полимеразная цепная реакция
in vivo – в составе вектора
3. Секвенирование - определение нуклеотидной последовательности ДНК
4. Лигирование ДНК - восстановление ковалентной связи в молекуле ДНК
и др.
Молекулярное клонирование (получение рекомбинантной ДНК)
Получение трансгенных организмов

3.

Использование методов генной инженерии
позволяет решать различные задачи:
Научные задачи
-изучение структуры
и функции генов
-регуляция работы
генов
-изучение геномов
различных организмов
-редактирование
геномов
Прикладные задачи
-биотехнология
Медицина
-диагностика наследственных
заболеваний
-моделирование болезней
человека на модельных организмах
-генотерапия
-вакцины

4.

Молекулярное клонирование (получение рекомбинантной ДНК)
I
II
III
Хромосомная
ДНК
Плазмидная
ДНК
рек
ДНК
I
IV
рек
ДНК
II
III
Хромосомная
ДНК
I этап — выделение и очистка вектора и ДНК, несущей ген интереса;
II этап — подготовка фрагмента ДНК и вектора к клонированию (формирование концов,
амплификация, очистка);
III этап — лигирование фрагмента в вектор;
IV этап — перенос рекДНК в реципиентные клетки. Реципиентные клетки далее
используются для амплификации плазмиды с рекДНК.

5.

Ферментативный гидролиз ДНК за счет нуклеаз
Неспецифичный гидролиз
(экзо- и эндонуклеазы)
-укорочение ДНК с 5’ или 3’-конца
-полная или частичная деградация ДНК
-фрагментация ДНК
и т.д.
Специфичный гидролиз
(эндонуклеазы рестрикции)
-фрагментация ДНК
-картирование ДНК
-клонирование ДНК
и т.д.
CH3
CH3
Система рестрикции-модификации
у прокариот (бактерии и археи)

6.

Специфическое разрезание ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции,
узнающих палиндромные последовательности
EcoRI
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
EcoRI - Ecsherichia coli штамм R

7.

Некоторые рестриктазы II типа
Фермент
Бактерия-хозяин
Сайт
узнавания
Тип образуемых
концов ДНК
Частота
EcoRI
Escherichia coli
5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
Липкие
1 / 4096
HaeIII
Haemophilus aegyptus
5’-GGCC-3’
3’-CCGG-5’
Тупые
1 / 256
HpaII
Haemophilus parainfluenzae
5’-CCGG-3’
3’-GGCC-5’
Липкие
1 / 256
NotI
Nocardia otitidis
5’-GCGGCCGC-3’
3’-CGCCGGCG-5’
Липкие
1 / 65536
PstI
Providencia stuartiii
5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’
Липкие
1 / 4096
SmaI
Serratia marcescens
5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’
Тупые
1 / 4096
E – род, co - вид

8.

Задача 1
Напишите результаты гидролиза эндонуклеазами рестрикции (в
скобках указаны палиндромы, которые они узнают, место гидролиза
обозначено как /):
- BamHI (5’-G/GATCC-3’)
- SmaI (5’- CCC/GGG-3’)
- Sau3AI (5’-/GATC-3’)
-Pst I (5’-CTGCA/G-3’)
-Сделайте вывод о концах ДНК, образовавшихся при гидролизе
данными эндонуклеазами рестрикции.
-Какие из образовавшихся концов можно объединить между собой?
-В чем разница между концами ДНК, полученными при обработке
ультразвуком
и
эндонуклеазами
рестрикции,
узнающими
палиндромные последовательности?
-Если гидролизовать геномную ДНК человека (3 x 109 нуклеотидов на
гаплоидный геном) эндонуклеазой BamHI (или Sau3AI) сколько
образуется фрагментов (предположим, что нуклеотиды расположены
случайным образом)?

9.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)- процесс амплификации участка ДНК (in vitro)
Цикл 2
Цикл 1
n циклов
1. Денатурация (92-98₀C)
Цикл 3
2. Отжиг праймера (50-70₀C)
3. Элонгация (72₀C)синтез ДНК с помощью
термостабильной
ДНК-полимеразы и dNTPs
n= 25-40 циклов

10.

Задача 2
1. Вам нужно амплифицировать последовательность. Подберите два 10нуклеотидных праймера для его амплификации. Что вам еще понадобится для ПЦР?
5’ – TTATACGTATGGACTATGСАТСTGACTGCTAGC – 3’
3’ – AATATGCATACCTGATACGTAGACTGACGATCG – 5’
5’
3’
Праймер 1
3’
Праймер 2
5’
2. Добавьте на 5’- концы праймера последовательность палиндрома GAATTC.
Запишите получившиеся праймеры в направлении 5’-3’. Для чего это может быть
нужно?
Для стандартной ПЦР требует праймер длиной 18-20 нуклеотидов, в особых случаях
40 и более нуклеотидов. Обычно их называют прямой и обратный. Их синтез
осуществляется на синтезаторах в специализированных фирмах.

11.

Визуализация ПЦР-продуктов
1. С помощью электрофореза в агарозном геле с последующим окрашиванием
флуоресцентными красителями
2. С помощью флуоресцентной краски (SYBR Green) в режиме онлайн

12.

Бактериальные векторы для клонирования ДНК, основные компоненты
AmpR
MCS
EcoRI
BamHI
SmaI
PstI
HindIII
XhoI
ori
1. Селективный маркер (ген устойчивости к антибиотику, например, AmpR)
2. Ориджин репликации (ori)
3. Сайт для клонирования ( MCS- multiple cloning site)
Размер плазмиды определяет ее свойства: стабильность и эффективность
трансформации. Обычно используют плазмиды размером от 4 до 20 тыс. п.о. Если
требуется нарабатывать белок, ген клонируют в вектора для экспрессии.

13.

Бактериальные векторы для клонирования ДНК: плазмида pUC19

14.

15.

Челночные векторы для клонирования ДНК: плазмида pRS316
(способна к размножению в E.coli и дрожжах)

16.

Клонирование ПЦР-фрагмента и его амплификация с составе вектора (in vivo)
ДНК-лигаза
рестриктаза
рестриктаза
Трансформация клеток E.coli
E.coli
Вопрос:на какой среде отбираются клоны кишечной палочки с плазмидой?

17.

Общая схема
клонирования
фрагментов ДНК
Выделение плазмидной ДНК
из отдельных клонов,
рестрикционный анализ
(см. следующий слайд)
Отбор плазмид со вставкой
целевого фрагмента ДНК
ДНК-лигазы

18.

Рестрикционный анализ – это установление наличия и расположения сайтов
узнавания эндонуклеаз рестрикции в молекуле ДНК. Конечной целью рестрикционного
анализа является построение физической карты исследуемой ДНК. В качестве меток в
рестрикционной карте используют сайты узнавания отдельными ферментами с указанием
расстояния между ними, выраженное в т.п.н. (тысячах пар нуклеотидов).

19.

Задача 3
Эндонуклеазы рестрикции используют как на этапе клонирования, так и на этапе
проверки генетических конструкций (рестрикционный анализ).
Вы проклонировали ПЦР-фрагмент по сайту BamHI в вектор и вам необходимо
проверить вашу плазмиду с помощью рестрикционного анализа. Размер ПЦР фрагмента
1000 п.н., размер вектора 6000 п.н. Ваши действия?
-Каким методом, кроме рестрикционного анализа, можно определить наличие вставки в
вектор?
BamHI
BamHI
7000 п.н.

20.

Рестрикционный анализ индивидуальных плазмид
(отбор плазмид со вставкой целевого фрагмента ДНК)
Чаще всего (но не обязательно) выделенные плазмиды обрабатывают той
же рестриктазой, которой обрабатывали вектор и фрагмент в процессе клонирования.
В случае искомой плазмиды со вставкой видим на форезе 2 полосы, соответствующие
вектору и фрагменту (пробы 1, 3,6-10)
В случае замыкания вектора на себя (без вставки) – видим одну полосу (пробы 2, 4, 5, 11, 12)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

21.

Задача 4
Известно, что патология роста занимает третье место в структуре детской
эндокринной патологии. Для ряда заболеваний (например, синдром ШерешевскогоТернера) требуется препарат гормона роста человека. Вам необходимо получить этот
белок в больших количествах. Вы будете нарабатывать белковый продукт в клетках
E.coli. Предложите схему эксперимента.

22.

Использование эндонуклеаз рестрикции для гидролиза геномной ДНК и ее
Анализа (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов)
I
Геномная ДНК
HindIII или EcoRI
HindIII
EcoRI
HindIII
HindIII
5 т.п.н.
зонд EcoRI
HindIII
3 т.п.н.
8 т.п.н.
5 т.п.н.
EcoRI
HindIII
II
HindIII
HindIII
HindIII
5 т.п.н.
6 т.п.н.
HindIII
HindIII
2 т.п.н.
Вопрос: как провели данный эксперимент и что было обнаружено?

23.

Задача 5
Развитие синдрома Мартина –Белла (ломкость X-хромосомы) связано с экспансией
единичных тринуклеотидов (СGG) в Х-хромосоме и приводит к недостаточной
экспрессии белка FMR1, который необходим для нормального развития нервной
системы. Нормальное количество повторов (отсутствие синдрома) — от 29 до 31.
Премутация (PM) — от 55 до 200 повторов (синдром не развивается). Полная
мутация(FM) — более 200 повторов (обычно от 230 до 4000), при которой
проявляется синдром.
В семье мать (пробанд) имела синдром Мартина-Белла. Ей была сделана пренатальная
диагностика, на основании которой беременность была прервана. Почему? Какие
методы были использованы? Какой кариотип у матери ?

24.

Секвенирование ДНК по
методу Сэнгера

25.

Секвенирование (по Сэнгеру)- определение нуклеотидной последовательности ДНК
В качестве матрицы для секвенирования можно использовать как ПЦР-фрагмент,
так и плазмидную ДНК с геном интереса.

26.

Задача 6
Вы провели секвенирование участка ДНК двух плазмид и обнаружили в одной
последовательности мутацию, которая приводит к исчезновению сайта BamHI (GGATCC),
необходимого вам для клонирования. Какой из двух приведенных сиквенсов (№1 или №2)
содержит фрагмент ДНК с мутацией?

27.

Метод секвенирования ДНК по Сэнгеру с флуоресцентными метками
Флюоресцентные красители
Название
Абсорбция
Эмиссия
FAM
490–495 нм
515–520 нм
JOE
520–525 нм
550–555 нм
TAMRA
550–555 нм
580–585 нм
ROX
580–585 нм
605–610 нм

28.

Задача 7
Посмотрите на 2 сиквенса и объясните наличие 2 пиков справа.

29.

Стратегия секвенирования геномов
Геномная ДНК
Фрагментация геномной ДНК
( 300-500 нуклеотидов)
Секвенирование фрагментов ДНК
Сборка генома с помощью методов
биоинформатики

30.

Домашнее задание
Задача 1
Какие из сайтов GATC, CGATCG, AAСGTT, ACGGCC могут быть сайтами узнавания для эндонуклеаз рестрикции класса
II.
Задача 2
Придумайте гипотетический сайт, состоящий из 8 нуклеотидов, для узнавания эндонуклеаз рестрикции класса II,
если сайт имеет на 5’-конце последовательность GA. Какие липкие концы образуются в ДНК, если эндонуклеаза
рестрикции делает разрез сразу за последовательностью GА?
Задача 3
При рестрикции кольцевой плазмидной ДНК размером 12 т.п.н. с помощью BamHI и HindIII были получены
следующие результаты: при гидролизе BamHI – фрагменты 8 и 4 т.п.н., при гидролизе HindIII фрагменты 4,5 и 7,5
т.п.н., при совместном гидролизе BamHI и HindIII – фрагменты 1.5, 2, 2.5 и 6 т.п.н. Постройте рестрикционную карту
плазмиды.
Задача 4
В плазмиду pBR322 встроили фрагмент ДНК по сайту SalI размером 1000 п.н. Как доказать, что выделенная вами
плазмида представляет собой рекомбинантную, а не исходную плазмиду.
Задача 5
Вирусы герпеса типов 6 и 7 широко распространены среди людей. С действием этих вирусов связывают развитие
таких недугов, как ложная краснуха, синдром хронической усталости и синдром иммунной депрессии. Как вы
докажете методом полимеразной цепной реакции наличие герпеса у пациента?
Задача 6
Вам необходимо проанализировать наличие мутации в гене Х у пациента (в первом варианте мутация –замена 1
нуклеотида, во втором - экспансия тринуклеотидного повтора). Как вы будете это делать?
Задача 7
Для удобства изучения геномов различных организмов создаются банки генов для каждого организма. Для этого
геном гидролизуют с помощью эндонуклеазы рестрикции Sau3AI (N/GATCN, где N – любой нуклеотид), а затем
лигируют с вектором, который предварительно расщепили BamHI (G/GATCС). Почему возможно такое лигирование?
Почему для разрезания генома используют Sau3AI, а для разрезания плазмиды BamHI?