Векторные системы для переноса генов в клетки

1. Векторные системы для переноса генов в клетки

Чепульченко Мария

2.

• В настоящее время существует два подхода
для получения необходимого количества
конкретного участка исследуемой ДНК:
• 1. Клонирование ДНК in vivo в клетках
прокариот или эукариот (клонирование –
получение клона, т.е. совокупности
идетничных клеток).
• 2. Амплификация ДНК in vitro методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР).

3.

Для клонирования ДНК in vivo нужно:
• ДНК-вставка (ДНК-мишень, ДНКинтереса);
• ДНК-вектор (генетический вектор
клонирования);
• клетка-хозяин;
• набор ферментов-инструментов и
вспомогательных олигонуклеотидов

4.

В основе молекулярного клонирования
лежит встраивание нужного фрагмента
ДНК (вставки) в другую молекулу ДНК
(вектор), которая способна включать в
себя новые последовательности ДНК,
обеспечивать их перенос в системы, где
созданная in vitro ДНК будет
воспроизводиться in vivo, давая начало
новому клону клеток, отличному
фенотипически от исходных клеток
хозяина (реципиента).

5.

• Вектор для переноса генетической информации
должен удовлетворять ряду основных требований:
• 1. Способность к автономной репликации, т.е.
обладание ori (точка инициации репликации).
• 2. Небольшой размер, поскольку эффективность
переноса экзогенной ДНК в E.coli значительно
снижается при длине плазмиды более 15 т.п.н.
• 3. Наличие уникального сайта рестрикции для
какой-либо РЭ.
• 4. Наличие селективного маркера, позволяющего
вести отбор рекомбинантных ДНК.
• 5.Обеспечение достаточной копийности
рекомбинантной ДНК в используемой
биологической системе.

6.

ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ
• Плазмиды – внехромосомные
автономнореплицирующиеся двухцепочечные
кольцевые молекулы ДНК.
• Плазмидные векторы создают на основе
природных плазмид (F-плазмиды, R-плазмиды,
плазмиды деградации, криптические плазмиды)
методами генной инженерии с использованием
ферментов-инструментов.
• Высококопийные плазмиды представлены 10-1000
копиями ДНК на клетку. Низкокопийные
присутствуют в клетке в числе 1-4 копий.

7.

Вектор клонирования pBR322
был создан Боливаром и Родригесом в 80-тые годы прошлого
века – один из самых популярных универсальных векторов для
клонирования ДНК.
Гены устойчивости
к тетрациклину(
)
и ампициллину (
)
содержат уникальные сайты
узнавания для
HindIII, SalI, BamHI и PstI.
Сайты EcoRI и PvuII расположены
вне этих генов.
Длина вектора — 4361 п.н.

8.

• Фенотипические свойства клеток, содержащих
плазмиду pBR322 со вставками и без них

9.

10.

• Трансформация – процесс введения
рекомбинантной ДНК в бактериальную
клетку.
• Клетка-хозяин должна иметь
определенный фенотип:
• r , т.е. в ней не должно быть рестриктаз;
• она должна быть неспособна к общей
рекомбинации (recA ), чтобы экзогенная
ДНК не модифицировалась в результате
гомологичной рекомбинации.

11.

• Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК,
называются компетентными.
• 1. Трансформация E.coli с помощью обработки
хлоридом кальция
• 2. Электропорация – увеличение проницаемости
клеток под воздействием импульса тока
длительностью ~4,5 мс.
• 3. Введение чужеродной ДНК в составе
искусственных бактериальных хромосом (BAC).

12.

• Селективный отбор на основании присутствия –отсутствия
резистентности к определенному антибиотику

13.

•• Эпоха вектора pBR322, начатая
Боливаром и Родригесом в самом
начале 80-тых годов ХХ-го столетия,
продолжается и по сей день.
• Однако, при всей своей надежности и
классическом соответствии всем
необходимым для векторов
требованиям, этот вектор имеет всего
несколько удобных сайтов для
клонирования. Кроме того, отбор
трансформированных клеток в
экспериментах с рекомбинантными
ДНК на его основе занимает много
времени.

14.

•
Группа векторов семейства pUC
• “unicom cloning” – обозначает наличие в структуре
ДНК полилинкера, который представляет собой
последовательность нуклеотидов, составленную
из сайтов узнавания ряда эндонуклеаз рестрикции,
уникальных для данного вектора.
• .

15.

Плазмидный вектор pUC19
pUC19 содержит:
-ген устойчивости к ампициллину (Amp);
-регулируемый сегмент гена β-галактозидазы (lacZ) лактозного
оперона E.coli;
-ген lacI, кодирующий репрессор, который контролирует
экспрессию гена lacZ;
-полилинкер – короткую последовательность с множеством
уникальных сайтов для РЭ;
-точку начала репликации
плазмиды pBR322.

16.

ВЕКТОРЫ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ КРУПНЫХ
ФРАГМЕНТОВ ДНК
С помощью плазмидных векторов можно
клонировать фрагменты ДНК до 10 т.п.н. Однако
при создании геномных библиотек часто
приходится работать с более крупными
фрагментами. Для этого были разработаны
векторы:
1. На основе ДНК фагов, в частности, на основе
ДНК бактериофага λ E.coli.
2. Космиды.
3. Искусственные бактериальные хромосомы
(BAC).

17.

Космиды – один из видов гибридных векторов, которые
реплицируются, используя плазмидный тип репликации, и
обладают способностью упаковываться in vitro в оболочки
частиц фага λ. Такие векторы могут включать до 40 т.п.н.
чужеродной ДНК.

18.

Векторные системы для клонирования
очень крупных фрагментов ДНК (вставки
>100 т.п.н.) имеют большую ценность при
анализе сложных эукариотических
геномов. Для клонирования фрагментов
ДНК размером от 100 до 300 т.п.н. был
сконструирован низкокопийный
плазмидный вектор на основе
бактериофага Р1 –искусственная
хромосома на основе фага Р1. На основе
F-плазмиды E.coli создана BAC (bacterial
artificial chromosomes).