Методы генетики человека. Занятие 7

1.

Семинарские занятия по
общей генетике
Занятие 7
Методы генетики человека

2.

Методы генетики человека
1. Генеалогический (метод родословных)
2. Близнецовый*
3. Популяционный**
4. Метод соматической гибридизации*
5. Цитогенетический
6. Молекулярно-биологический
*- лекционный материал
**- занятие 8

3.

I.
Генеалогический метод (метод родословных)
-применяют вместо гибридологического в генетике человека
-метод позволяет установить тип наследования, сцепление генов
и посчитать расстояние между генами при анализе большого
количества родословных
-в настоящее время есть программы для составления родословных
-важны для методов косвенной диагностики наследственных
заболеваний (молекулярные методы диагностики)
Недостатки:
- неслучайная выборка семей: обычно анализируют семьи, где хотя бы один
человек болен;
- не всегда сведения являются достоверными, т.к. в анализ могут попадать
внебрачные дети; а также встречаются случаи, связанные с подменой детей
при рождении.

4.

Правила составления родословной
здоровый мужчина
пробанд
здоровая женщина
здоровое лицо
неизвестного пола
гетерозиготные
носители признака
больной мужчина
больная женщина
больной
неизвестного пола
брак
родственный брак
дизиготные
близнецы
выкидыш
монозиготные
близнецы
умершие люди
мертворожденные
• составление родословной начинают с пробанда. При наличии нескольких детей в
семье дети (сибсов) изображаются слева направо, начиная со старшего.
• все члены родословной должны располагаться строго по поколениям в один ряд.
поколение обозначают римскими цифрами слева от родословной сверху вниз.
Арабскими цифрами нумеруют потомков одного поколения (весь ряд) слева направо
последовательно. Таким образом, каждый член родословной имеет свой шифр
(например, II-3, I-2 и т. д.).

5.

Определение по родословной основных типов наследования
1. Аутосомно-доминантный
В.
Г.
Вопрос: какие заболевания наследуются по данному типу?
Что можно сказать об особенностях данного типа наследования?

6.

2. Аутосомно-рецессивный
серповидно-клеточная
анемия, муковисцидоз,
галактоземия,
мукополисахаридозы и др.
3. Сцепленный с X-хромосомой доминантный
дефект зубной эмали,
фолликулярный
гиперкератоз

7.

3. Сцепленный с X-хромосомой рецессивный
гемофилия А и В
дальтонизм,
мышечная дистрофия
Дюшенна,
агаммоглобулинемия,
ихтиоз
4. Сцепленный с Y-хромосомой (голандрический)
гипертрихоз

8.

5. Материнский (цитоплазматический)
атрофия зрительного нерва Лебера,
митохондриальная энцефалопатия,
миоклональная эпилепсия и др.

9.

Задача 1. Определите по родословной тип наследования признака.
A
Б
Г
В
Д

10.

Пренатальная диагностика, забор материала для цитогенетического и
молекулярно-генетических методов (инвазивная)
Забор ворсин
хориона (плацента)
Амниоцентез – забор
амниотической жидкости
Кордоцентез –
забор крови из
пуповины
10

11.

Предимплантационое генетическое тестирование (ПГТ)
метод, который выявляет у эмбрионов, полученных в результате ЭКО, генные и
хромосомные патологии.
Проверка на:
-анеуплоидии
-структурные хромосомные перестройки
- моногенные заболевания

12.

II. Цитогенетический метод – метод изучение кариотипа и отдельных хромосом
-Кариотипирование – окрашивание хромосом позволяет выявлять анеуплоидии
(нарушение числа отдельных хромосом) за счет анализа и числа и формы хромосом.
-Дифференциальная окраска хромосом -позволяет выявлять комплекс поперечных
темных и светлых полос (дисков) на хромосомах для ее картирования и обнаружения
крупных хромосомных перестроек.
-Окрашивание хромосом флуоресцентными метками (FISH) -метод гибридизации ДНК
in situ позволяет осуществлять прямое (таргетное) физическое картирование для
детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на
хромосомах.*
-Матричная сравнительная геномная гибридизация (aCGH) и хромосомный
микроматричный анализ (XMA) позволяют определять структурные изменения
количества генетического материала в хромосомах, например, микроделеции и
микродупликации участка хромосомы, обладает более высоким разрешением по
сравнению с рутинным кариотипированием.**
* Был рассмотрен на занятии 5
** В рамках данного курса не будут рассмотрены

13.

Кариотипирование и дифференциальная окраска хромосом. G-окраска хромосом,
мужской и женский кариотип
46,XY
46,XX
Группы хромосом
A: 1 — 3 хромосомы
B: 4 — 5 хромосомы
C: 6 —12 + X-хромосома
D: 13 — 15 хромосомы
G-бэндинг от красителя Гимза (от англ. Giemsa)
E: 16 — 18 хромосомы
F: 19 — 20 хромосомы
G: 21 — 22 + Y-хромосома
13

14.

Задача 2.
Что обозначают следующие записи?
46,XY/47,XXY
47,XX,+13
45,X0 или 45,X0/46,XX
47,XX, +21
47,XXX
47,ХХ, +С
69,XXY (69,XXX)
92,XXXX
Мозаицизм — это состояние, при котором в организме присутствуют клетки с
разными наборами хромосом: часть клеток характеризуется нормальным набором
хромосом, а другая – наличием дефектной хромосомы. Мозаичная форма может
наблюдаться при синдромах Дауна, Клайнфельтера, Шерешевского–Тёрнера, Эдвардса.

15.

Идиограммы хромосом человекаграфическое изображение рисунка дифференциальной окраски хромосом
Центромера
Короткое плечо (p)
Бэнды (блоки)
Длинное плечо (q)
Международнуая система по цитогенетической номенклатуре человека
(The International System for Human Cytogenetic Nomenclature — ISCN)
15

16.

Уровни разрешения цитологических карт
определяется количеством выявляемых блоков на гаплоидный набор
Цитогенетическая карта
10 хромосомы человека
Цитогенетические символы:
10p12.31
-
400
550
800
число блоков
№ хромосомы (10)
плечо (р – короткое, q - длинное)
район (1)
сегмент (блок, бэнд) (2)
подсегмент (3)
подподсегмент (1)
Вопрос: как
местоположение
зашифрованное
символами: 2p34.2
описать словами
гена
X,
следующими
16

17.

Номенклатура хромосомных мутаций
Делеции (del)
Дупликации (dup)
тандемная
Инверсии (inv)
Инсерции (ins)
Транслокации
Реципрокная (t)
Робертсоновская (der,rob)
парацентрическая
перицентрическая
17

18.

Примеры синдромов, возникающих из-за хромосомных перестроек
46,ХХ,del(5)(р12) синдром кошачьего крика ( Синдром Лежьена)
-Делеция 2 сегмента 1 района короткого плеча 5-й хромосомы
45,XX,rob(13,21)(q10;q10)
семейный синдром Дауна
- Робертсоновская транслокация хромосомы 21 и 13. Указаны точки разрыва.
46,XX,t(9;22)(q34;q11) хронический миелолейкоз (филадельфийская хромосома Ph)
-Реципрокная транслокация между хромосомами 9 и 22. Происходит рекомбинация
генов BCR и ABL с формированием слитного гена BCR-ABL, который продуцирует
химерный белок с измененной тирозинкиназной активностью.
Робертсоновские транслокации являются одним из наиболее распространенных типов
врождённых хромосомных аномалий у человека. По некоторым данным, их частота
составляет 1:1000 новорождённых. Большинство робертсоновских транслокаций
затрагивают 13-ю и 14-ю хромосомы.

19.

Задача 3.
Что обозначают следующие записи?
46,XY,dup(5)(q25)
46,XY,ins(5; 2)(q31;p23p13)
46, XX, inv(3)(p25:q21)

20.

Молекулярно-генетические методы в генетике человека:
- Позволяют анализировать различия отдельных
индивидуумов в нуклеотидной последовательности ДНК
(полиморфизм)
- Применяют в пренатальной диагностике наследственных
заболеваний, установлении гетерозиготного носительства
мутаций, в криминалистике, суд.-мед. экспертизе,
установлении отцовства и т.д.
Отличие между мутациями и полиморфизмом довольно условно: когда один
из вариантов нуклеотидных последовательностей участка ДНК выявляется
более чем у 1 % людей в популяции и не приводит к развитию заболевания,
это называется полиморфизмом, если же менее 1 % или с высокой
вероятностью приводит к болезни — мутацией.
20

21.

Варианты ДНК-полиморфизма в геноме человека
SNP
Аллель 1
Аллель 2
Вставка нуклеотида
Аллель 1
Аллель 2
Выпадение нуклеотида
Аллель 1
Аллель 2
Повторы ДНК
1. Уникальные
2. Тандемные (повторяющиеся друг за другом)
а. Сателлитные
б. Минисателитные (до 100 нуклетидов, 5-50 раз)
в. Микросателлитные (2-6 нуклеотидов, 5-50 раз) -STR
3. Диспергированные (разбросаны по геному)
GACСАСАСАCTG
GACCACACACACTG
GACCACACACACACTG
SNP –single nucleotide polymorphism –однонуклеотидный полиморфизм
STR-short tandem repeat –короткие тандемные повторы

22.

В молекулярной диагностике широко используют
молекулярные ДНК-маркеры – третье поколение
генетических маркеров (после морфологических и
биохимических), позволяющих анализировать организм
на уровне ДНК.
Молекулярный маркер соответствует гену или
некодирующему участку генома, разные варианты
(аллели) которого отличаются на уровне ДНК
(полиморфизм).
22

23.

ДНК-маркеры
Основной метод диагностики
1.
SNP-маркеры
Секвенирование
2.
STR-маркеры
ПЦР +фрагментный анализ
3.
ПЦР-ПДРФ
ПЦР+рестрикция+гель-электрофорез
ПЦР-ПДРФ
AA
aa
Aa
Вопрос: определите генотип генотип людей 1, 2 и 3.
1
2
3

24.

Задача 4. Перед вами результат молекулярной диагностики мутации в гене CUL7 с
помощью ПЦР-ПДРФ. ПЦР-фрагмент гена получается размером 240 п.о. Определите
какой аллель (содержащий сайт рестрикции HinfI или несодежащий сайта рестрикции)
является мутантным. Выявите всех гетерозиготных носителей в родословной.
I
I-1
I-2
II
II-1
II-2
II-3
M
I-1
II-2
II-4
I-2
II-5
II-6
II-1
II-3
II-4
II-5
II-6
240 п.о
125 п.о
115 п.о
24

25.

Анализ SNP с помощью секвенирования
Задача 5.
Определите по хроматограмме гетерозиготное носительство
мутации в гене CFTR (муковисцидоз).
С
G
T
A
В случае гетерозиготы по небольшой делеции будет наложение
хроматограмм, соответствующих нормальной аллели гена и аллели с
делецией (с позиции делеции будет множество сдвоенных пиков).
25

26.

Задача 6. Запись некоторых мутаций в гене CFTR. Заполните
таблицу.
Изменение в
нуклеотидной
последовательности
расшифровка
Изменение в
аминокислотной
последовательности
расшифровка
Тип мутации
с.1364C>A
?
p.Ala455Glu
?
?
c.1657C>T
?
p.Arg553X
?
?
c.1521_1523delCTT
?
p.ΔPhe508
?
?
c.2052delA
?
p.Lys684Asn
?
?
c.351G/A
?
p.Arg553Arg
?
?
с. – кДНК
> – значимая замена нуклеотида
del, Δ – делеция
/ - незначимая замена нуклеотида
X- стоп-кодон

27.

Использование STR-маркеров в генетике человека
Локус 1
Аллель 1
Аллель 2
Задача 7.
Для семьи с рецессивным заболеванием, сцепленным с Х-хромосомой,
проведена ДНК-диагностика с помощью STR-маркера. Кто из членов семьи является
носителем патологического гена? С каким вариантом маркера он сцеплен? Какой из
дочерей потребуется пренатальная диагностика плода?

28.

Использование мультиплексной ПЦР для одновременной
детекции нескольких STR-маркеров
R1
1.
R2
F2
F1
R1
2.
R3
F1
F3
R1
3.
F2
F1
R3
R2
F3
1 2 3 М
F1+R1
F2+R2
F3+R3
В мультиплексной ПЦР используют одновременно несколько пар праймеров к
разным локусам ДНК. Часто разные пары праймеров метят разными
флуоресцентными красителями для их последующей детекции.
28

29.

Детекция STR-маркеров с помощью фрагментного
анализа (на секвенаторах)
С помощью капиллярного гель-электрофореза
TH01
D3
D5
D21
VWA
Penta E
D16
D13
D7
AMEL
D18
D8
TPOX
CSF
Penta D
FGA
AMELOGENIN
Указаны названия маркеров и число повторов
С помощью
агарозного гельэлектрофореза

30.

Пример установления отцовства с помощью STR-маркеров

31.

Задача 8.
На панелях А и Б представлены результаты электрофоретического разделения
ПЦР-продуктов по маркерам STR1 и STR2 (AL-аллели полиморфного маркера,
AF- предполагаемый отец, С- ребенок, М- мать, K- другой человек, контроль).
Использование какого STR-маркера дает основание считать, что пациент не
является биологическим отцом ребенка?
Обычно используют 15 STR-маркеров для точного анализа на отцовство

32.

Задача 9.
На рисунке представлены результаты электрофоретического разделения
продуктов амплификации STR маркера TH01 у предполагаемых отцов, матери и
ребенка. Установите отца (предполагаемого, т.к. анализа по одному маркеру
недостаточно).
THO1- STR находится в интроне 1 гена тирозингидроксилазы (11p15.5–p15, мотивTCAT)

33.

Пример использования STR –маркеров в криминалистике
Вопрос:кровь кого из подозреваемых найдена на месте преступления?
33

34.

Косвенная диагностика с использованием маркеров STR
R
F
Ген Х без мутаций
R
Ген Х содержит мутацию
F
R
Ген Х без мутаций
Фланкирующая
область
STR-маркер
F
F
R
Праймеры к области,
фланкирующей STRмаркер
Аллель 1b гена Х содержит мутацию, приводящую к заболеванию. Аллель
1b тесно сцеплена с STR-маркером, содержащим 6 повторов
34

35.

Косвенная диагностика с использованием маркеров STR
-Косвенную диагностику проводят, если прямая диагностика либо затруднена,
либо слишком дорогая.
В гене CFTR идентифицировано порядка 700 мутаций, приводящих к
муковисцидозу, из них 5 наиболее часто встречающиеся и их чаще всего
тестируют методами прямой диагностики. Сам ген очень большой – 230
000 п.о. – секвенировать целиком очень дорого.
- В косвенной диагностике используют STR-маркеры, которые должны быть
либо тесно сцеплены с геном, либо находиться внутри гена (например, в
одном из интронов гена) .
-Косвенную диагностику всегда дополняют данными родословной и проводят
только для группы родственных индивидуумов.
35

36.

Задача 10. Перед вами стоит задача провести ПГТ эмбрионов методом косвенной
диагностики. Женщина является носителем мутации в гене m, приводящей к
миодистрофии Дюшенна. C геном М тесно сцеплен локус STR.
М – нормальный аллель, m – мутантный, приводящий к заболеванию.
Миодистрофия наследуется как сцепленный с Х-хромосомой рецессивный признак.
Для процедуры ЭКО вам необходимо выбрать эмбрионы, которые в будущем не будут
страдать от миодистрофии . На гельэлектрофорезе слева – результат диагностики
родителей, 1-13 – полученных эмбрионов. Пара мечтает о рождении сына, можно ли
установить пол будущих детей?
STR(5)
m
Х
M
STR(7)
STR(7)
M
STR(3)
1
2
3
4
5
6
7 8
STR(5)
STR(3)
Праймеры к флангам SRT-локуса
STR (5) - 5 – число повторов
9 10
11 12
13

37.

Домашнее задание
Задача1 . Перед вами результат секвенирования трех членов родословной в гене В,
мутация в этом гене приводит к синдрому Барде-Бидля. Cравните
последовательность нуклеотидов трех членов родословной, установите их генотип и
молекулярную природу мутации в гене В.
IV-1
IV-2
IV-3

38.

Задача2 . В роддоме перепутали детей. Помогите мед.персоналу избежать
скандала и определить, какой паре принадлежит какой ребенок по
данным ДНК-диагностики.
38

39.

Задача 3. В результате мутации произошла потеря рестрикционного сайта EcoRI
(GAATTC) . Нарисуйте родословную семьи с аутосомно-рецессивным заболеванием, где
мать гомозиготна по мутации и больна, отец здоров и гомозиготен. Какой генотип
ребенка, как это можно увидеть с помощью ДНК-диагностики (ПЦР-ПДРФ). Изобразите
пример возможных результатов гель электрофореза под родословной.
Задача 4.
К вам пришел пациент с результатом кариотипирования 45,XY, der(13;21)(q10;q10). Что это
значит? Какие последствия может иметь такой кариотип? Что можно предложить?

40.

Ответы

41.

Задача1.
A-аутосомно-доминантный
Б сцепленный с Х-хромосомой рецессивный
В сцепленный с Х-хромосомой доминантный
Г-аутосомно-рецессивный
Д голандрический
Задача 2.
Синдром Клайнфельтера, мозаик
Синдром Патау, анеуплоидия по 13 хромосоме
Синдром Шерешевского-Тернера или с мозаик
Синдром Дауна
Трисомия по Х хромосоме
Лишняя хромосома из группы С, из анализа плодного материала
Пузырный занос (было на лекции), Основной механизм формирования такой
патологии — оплодотворение яйцеклетки двумя сперматозоидами (диспермное
оплодотворение), что приводит к образованию организма с двумя наборами
отцовских и одним набором материнских хромосом. Большинство зародышей с
триплоидией элиминируются преимущественно в I триместре беременности.Одна из
наиболее частых спонтанных аномалий хромосомного набора в процессе
эмбриогенеза человека.

42.

Тетраплоидия.Примерно 22,6% всех спонтанных выкидышей обусловлены
полиплоидией.
Эта хромосомная аномалия может возникнуть различными способами:
при оплодотворении диплоидной (46) яйцеклетки диплоидным(46) сперматозоидом
при оплодотворении гаплоидной (23) яйцеклетки тремя гаплоидными
сперматозоидами
тетраплоидный (92) эмбрион возникнет, если нормальная зигота (клетка,
получившаяся в результате слияния) разделится на две нормальные клетки (46), но
затем эти клетки вновь сольются в одну
В настоящее время в литературе описаны всего лишь пять случаев рождения живых
детей с тетраплоидией. Все дети имели самые разнообразные пороки развития тела,
срок их жизни не превысил нескольких месяцев.
Задача 3.
Дупликация 5 сегмента 2 района длинного плеча 5-й хромосомы
Инсерция участка 2-й хромосомы на 5-ю
Инверсия участка 3-й хромосомы
Задача 4
I-1,I-2,II-3
Задача 5.
CTTCGGACA/GGCAGCCTTACT

43.

Задача 6:
Изменение в
нуклеотидной
последовательности
расшифровка
Изменение в
аминокислотной
последовательности
расшифровка
Тип мутации
с.1364C>A
Замена в 1364
положении С на А
p.A455E
Замена Ala на Glu в 455
положении
миссенс
c.1657C>T
Замена в 1657
положении С на Т
p.R553X
Появление стоп-кодона в
положении 553 вместо
Arg
нонсенс
c.1521_1523delCTT
Делеция нуклеотидов
СТТ в положении с 1521
по 1523
p.ΔF508
Делеция Phe в
положении 508
делеция
c.2052delA
Делеция А в положении
2052
p.K684N
Замена Lys на Asn в
положении 684, сдвиг
рамки
Сдвиг рамки
считывания
c.351G/A
Замена G на А в
положении 351
p.R553R
Синонимичная замена
Синонимичная
замена

44.

Задача 7.
Носителем мутантного гена является мать-1, и дочь-3.
Паталогический ген сцеплен с маркером М6. Дочери 3 потребуется ПД.Мальчики в
50% случаев больные.
Задача 8.
STR-1
Задача 9.
Отец-2
Задача 10.
m
Х
M
STR(7)
1
2
3
4
5
M
6
STR-локус, в скобках
– число повторов
7 8
9 10
11 12
13
STR(5)
STR(3)
Эмбрионы без мутации
Эмбрионы носители мутации