Фотометрирические методы

1.

ФОТОМЕТРИРИ
ЧЕСКИЕ
методы

2. ТИПЫ СПЕКТРОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Спектр представляет собой зависимость
количества поглощенной или излученной
системой энергии от длины волны или
другого параметра, например волнового
числа.
2

3.

Молекулы взаимодействуют с излучением в
широком диапазоне длин волн, поэтому их спектры
лежат в разных областях. Для измерений в каждом
спектральном диапазоне используется специальное
оборудование.
Одни типы спектров получить довольно легко, и
соответствующие методы широко используются в
повседневной работе клинико-диагностических
лабораторий. Однако есть область спектроскопии,
где применяется довольно сложное оборудование.
Соответствующие методы используются лишь для
детального
исследования
биологических
макромолекул и других субклеточных структур.
3

4.

Главное преимущество этих методов состоит в том, что
вещество в процессе исследования не разрушается.
Кроме
того,
методики
исследований
легко
модифицировать и автоматизировать. Оптические
методы позволяют обнаруживать незначительные
количества вещества даже в довольно сложных
системах.
В последнее время в практике рутинных исследований,
наряду
с
давно
использующимися
фотоколориметрическим и спектрофотометрическим
методами,
все
адсорбционную,
спектроскопию.
шире
применяют
инфракрасную
и
атомномасс4

5.

ПРИНЦИП МЕТОДА
При фотометрических определениях интенсивность
окраски или степень мутности определяемого раствора
сравнивают с окраской раствора, концентрация которого
известна. Наблюдения можно проводить визуально или с
помощью различных физических приборов. Визуальные
методы менее точны, чем определения с помощью
приборов, так как точность визуальной оценки во
многом зависит от способности глаз улавливать разницу
в интенсивности окраски или степени мутности
раствора. Имеются различные фотометрические методы:
спектрофотометрия,
фотоэлектроколориметрия,
колориметрия, нефелометрия, флюориметрия.
5

6.

Визуальная колориметрия — определение
содержания вещества по интенсивности
окраски
раствора,
получаемого
при
взаимодействии данного вещества с какимлибо реактивом, визуально. В данный
момент подобное определение концентрации
вещества в растворе является экзотикой и
представляет
интерес
для
людей,
интересующихся
историей
развития
лабораторной диагностики.
6

7.

Фотоэлектроколориметрия —
определение концентрации
вещества в растворе по изменению
силы тока в фотоэлементе при
падении на него луча света,
прошедшего через исследуемый
раствор (прозрачный, окрашенный).
7

8.

Спектрофотометрия — определение
содержания вещества по поглощению
раствором света определенной длины волны,
характерного для поглощения данным
веществом.
Нефелометрия — определение содержания
вещества по степени мутности раствора,
проводимое визуально или с помощью
приборов. В последнем случае определяют
концентрацию по интенсивности света,
рассеянного взвешенными частицами
суспензии и измеряемого фотоэлементом.
8

9.

Флюориметрия — метод определения
концентрации вещества по интенсивности
излучения, возникающего после поглощения
им энергии возбуждающего излучения.
Диапазон возбуждающего и возбуждаемого
оптического излучения достаточно широк и
простирается от УФ до ближнего ИК (около
220—1100 нм). Принцип метода
флюориметрии заключается в
пропорциональности между интенсивностью
фотолюминесценции анализируемого образца
и количеством определяемого вещества
9

10.

Чтобы вещество можно было
определить фотометрически, проводят
цветную реакцию и получают
окрашенный раствор. Для этой цели
применяют реакции окислениявосстановления, комплексообразования
и т.д. Цветные реакции, применяемые
в фотометрии, должны удовлетворять
ряду требований.
10

11.

1. Реакция получения окрашенного раствора должна
протекать с большой скоростью.
2. Полученное окрашенное соединение должно
обладать достаточно интенсивной окраской; чем
интенсивнее окраска, тем чувствительнее метод
анализа.
3. Окраска должна быть устойчивой во времени и
малочувствительной к свету. Интенсивность окраски
не должна изменяться с изменением температуры и
pH раствора. Если pH раствора оказывает заметное
влияние на интенсивность окраски, проведение
цветной реакции должно происходить при строго
определенной величине pH.
11

12.

4. Интенсивность окраски должна быть
прямо
пропорциональна
концентрации
окрашенного соединения.
5. Чтобы уменьшить отклонения, необходимо
работать в оптимальных условиях, выбрав
подходящие реагент и способ приготовления
окрашенных испытуемого и стандартного
растворов.
Чтобы приготовить окрашенный раствор
известной концентрации, применяют так
называемые стандартные растворы.
12

13.

Стандартный раствор
Стандартный раствор содержит точно
известное количество определяемого вещества.
Обычно концентрация стандартного раствора
выражается в миллиграммах вещества в 1 мл
раствора (мг/мл).
Стандартные растворы готовят обычно по
точно взятой навеске, если взвешиваемое
вещество удовлетворяет требованиям,
предъявляемым к веществам, из которых
можно готовить растворы точной
концентрации.
13

14.

При приготовлении окрашенных растворов
необходимо придерживаться определенных правил.
1. К стандартному и испытуемому растворам прибавляют
одинаковые реактивы в одной и той же
последовательности и в одних и тех же количествах.
2. Окрашенные растворы, стандартный и испытуемый,
готовят одновременно, так как часто интенсивность
окраски со временем изменяется.
3. Окрашенные растворы, стандартный и испытуемый,
должны быть одинакового объема. Поэтому окрашенные
растворы готовят в мерных колбах или в градуированных
пробирках.
4. Окраску испытуемого и стандартного раствора
сравнивают в одинаковых условиях.
14

15.

Принцип:
При прохождении светового потока через
окрашенную прозрачную жидкость часть
света поглощается. Степень поглощения
света (или коэффициент экстинкции) во
многих случаях прямо пропорциональна
интенсивности окраски раствора. Окраска
раствора зависит от концентрации в нем
растворенного вещества: чем выше
концентрация, тем интенсивнее окраска и тем
больше света поглощает раствор.
15

16.

Степень светопоглощения определяют в
фотоэлектроколориметре (ФЭК) путем
уравнивания интенсивности света,
прошедшего через исследуемый окрашенный
раствор, и света, прошедшего через
контрольный раствор. Необходимо
подчеркнуть, что с помощью ФЭК можно
исследовать только окрашенные растворы,
так как источником света является лампа
накаливания, поэтому приборы этого класса
могут работать только в видимой части
электромагнитного спектра.
16

17.

Современные фотометры позволяют
работать и в УФ-области, поскольку имеют 2
источника излучения (лампу накаливания и
ртутно-кварцевую), но в отличие от
спектрофотометров вместо
монохроматорав фотометрах используют
набор светофильтров.
17

18.

18

19.

19

20.

Кюветы
Исследуемое вещество растворяют в соответствующем
растворе и помещают в оптически прозрачный сосуд для
измерений — кювету. Обычно кюветодержатель имеет
ячейки для 4 кювет. Если нет какого- нибудь известного
стандартного вещества, для количественных измерений
необходимо точно определить размеры кюветы. Для
определения поглощения только исследуемого вещества
используется кювета сравнения, идентичная кювете с
образцом; в нее наливают только растворитель. Перед
проведением измерений кюветы сравнивают.
20

21.

Поскольку стекло поглощает УФ-свет, для проведения
измерений в этой области спектра используют кюветы из
кварцевого стекла. Для работы с летучими или химически
активными веществами кюветы закрывают крышками
(пробками).
21

22.

Поскольку кювета, помещенная в СФ, становится
составной частью его оптической системы, с ней
нужно обращаться очень аккуратно. Царапины и
грязь на стенках кюветы сильно рассеивают и
поглощают свет, искажая результаты измерений. Об
этом особенно надо помнить при работе в УФобласти. Поскольку органические молекулы
поглощают в ультрафиолетовой области, ни в коем
случае нельзя касаться руками оптических стенок
кюветы и вообще стараться по возможности меньше
брать кюветы в руки.
22

23.

Содержимое кюветы должно быть
гомогенным — это необходимое условие
получения воспроизводимых данных. Нужно
следить за тем, чтобы раствор не был
мутным. Особенно мешают измерениям
пузырьки воздуха, сильно увеличивающие
рассеяние. Нельзя наливать в кювету очень
холодный раствор, поскольку при этом на
наружных стенках кюветы конденсируются
пары воды из воздуха, и стенки становятся
непрозрачными.
23

24.

Если кюветы загрязнены посторонними
примесями,
их
следует
промыть
дистиллированной водой и (или)
растворителем, в котором растворено
исследуемое вещество. Кюветы можно
мыть мягкими детергентами, но
стараться не пользоваться горячими
концентрированными кислотами или
щелочами.
24

25.

Фотоэлементы преобразуют световую энергию
в электрическую. Электрический сигнал затем
усиливается и регистрируется. Фотоны,
бомбардируя поверхность фотоэлемента,
выбивают из нее электрон, количество
которых пропорционально интенсивности
света.
Эти
электроны
летят
к
положительному электроду; в результате в
замкнутой цепи возникает электрический ток,
который
регистрируется
по
падению
напряжения на сопротивлении, находящемся
в этой цепи.
25

26. КФК

26

27. Спектрофотометр - UNICOM

27

28.

28

29.

29

30.

Рис . Общий вид КФК-2.
1 - осветитель ; 2 - рукоятка ввода цветных светофильтров;
3 - кюветное отделение; 4 - рукоятка перемещения кювет ;
5 - рукоятка ( ввода фотоприемников в световой поток)
«Чувствительность »; 6 - рукоятка настройки прибора на
100%-е пропускание; 7 - микроамперметр.
30

31.

31